祝清燦

國藥集團同濟(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026

豬毛蒿為菊科植物豬毛蒿ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.的地上部分，經水蒸氣蒸餾法提取得豬毛蒿精油。豬毛蒿精油為淺黃色至棕黃色澄清液體，有特異香氣，味微辛，據文獻[1-4]報道，對真菌有很強的抑制作用，藏族地區(qū)民間常用于治療手、足癬等皮膚病，是藏藥婦潔搽劑[5]的主要成分之一。豬毛蒿精油化學成分以單萜為主(80.74%)，主要成分有丁香酚、桉葉素、檸檬烯、β-丁香烯、α-蒎烯、β-蒎烯等[6-8]。丁香酚是豬毛蒿精油中的主要成分，具有麻醉、抗菌防腐、殺蟲、解熱、降溫、抗性氧化、抗衰老等藥理作用[9]。Pinto等[10]研究發(fā)現(xiàn)丁香酚不僅對皮膚癬菌屬和曲霉菌屬具有抗菌活性，而且對氟康唑有天然耐藥的克柔念株菌和易誘導耐藥的光滑念珠菌均表現(xiàn)出較高的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌等12種細菌具有較好的抗菌作用[11-12]。

丁香酚存在于豬毛蒿精油中，是一種極具開發(fā)潛力的活性成分。為了控制豬毛蒿精油產品質量，確保臨床療效，本實驗采用薄層色譜法進行豬毛蒿精油鑒別，采用氣相色譜法(GC—MS聯(lián)用)對豬毛蒿精油中的丁香酚進行含量測定，為制定質量標準提供科學依據。

1 材料與儀器

安捷倫6890A-5973氣質聯(lián)用儀，AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，ZF-I三用紫外分析儀，YOKO-ZS薄層色譜成像儀(武漢藥科新技術開發(fā)有限公司生產)。

丁香酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110725-201414)，豬毛蒿精油對照提取物(中國食品藥品檢定研究院，批號：610007-201501)，豬毛蒿由青海省食品藥品檢驗所楊鳳梅主任鑒定，化學試劑為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)，硅膠G預制板(德國默克公司生產，批號HX242369)。

豬毛蒿精油樣品(批號為20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106)，由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產。

2 試驗方法與結果

2.1 鑒別 取本品100 mg，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取豬毛蒿油對照提取物，同法制成對照提取物溶液。再取丁香酚對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含5 μL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[13]試驗，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照提取物和對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點(A)。置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照提取物和對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點(B)。結果如圖1所示。

A 日光下檢視1～5.樣品 6.豬毛蒿精油對照提取物 7.丁香酚對照品 8～12.樣品

2.2 丁香酚含量的GC法測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：TR-5毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm)；載氣為高純氮氣，純度>99.999%。流速1.5 mL·min-1；柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘5 ℃的速率升溫至140 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持3 min；進樣口溫度為220 ℃；檢測器為240 ℃；分流進樣，分流比為10∶1。理論板數(shù)按丁香酚峰計算應不低于10000。如圖2所示。

A.丁香酚對照品 B.豬毛蒿精油供試品 C.溶劑圖2 豬毛蒿精油及丁香酚GC圖

在上述條件下，在圖2-A中，對照品丁香酚的峰出現(xiàn)在tR8.99,在圖2-B中，出現(xiàn)與對照品丁香酚保留時間相似的峰tR8.99，應為樣品中的丁香酚，且與樣品中其他組分色譜峰達到基線分離。

2.2.2 對照品溶液制備 取丁香酚對照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為測定用對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 專屬性試驗 對豬毛蒿油供試品溶液進行氣質聯(lián)用分析，具體參數(shù)如下：色譜柱：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為高純氦氣，純度>99.999%。流速1.2 mL·min-1；柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘10 ℃的速率升溫至240 ℃，保持4 min；進樣口溫度為250 ℃；檢測器為260 ℃；分流進樣，分流比為10∶1。電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；連接線溫度：280 ℃；四級桿溫度：150 ℃。結果：分子離子峰的質荷比為164.1，保留時間(9.96)與丁香酚峰相似，其裂解與丁香酚相同，豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰質譜圖與標準譜庫(安捷倫Chemstation色譜工作站NIST MS Search 2.0標準譜庫)中丁香酚的質譜圖匹配度為98%，其特征離子為77、103、149和164(其中164為定量離子)，且對應質譜碎片離子的質荷比與標準一致，其豐度比偏差在規(guī)定范圍內，因此可認為是同一物質。如圖3、圖4所示。

圖3 豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰的 MS圖

圖4 丁香酚對照品標準質譜圖

2.2.5 標準曲線制備 精密稱取丁香酚對照品0.04656g(含量按100.0%計算)，置50mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，濃度為931.2 μg·mL-1。精密吸取對照品儲備液，用乙酸乙酯稀釋配制成系列濃度標準溶液，濃度分別為：46.56、93.12、186.2、232.8、465.6 μg·mL-1。分別精密吸取系列濃度標準溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，按照“2.2.1色譜條件”測定。以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，線性回歸方程為：Y= 12599767.5X-23282.6(r=0.99999)。結果表明：丁香酚進樣量在0.04656～0.4656 μg范圍內與峰面積值具有良好的線性關系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號20180906)，分別于0、1、2、4、10 h測定其峰面積，按上述色譜條件測定，結果供試品丁香酚峰面積的RSD=1.7%。表明制備的供試品溶液在10 h內基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品(批號20180906)精密稱取0.1 g,各6份，按2.2.3項下的方法制備供試品溶液，進行含量測定，結果丁香酚含量的平均值為：52.52 mg·g-1，RSD為1.6%，說明試驗方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取丁香酚對照品0.04656g(含量按100.0%計算)，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，備用(含丁香酚0.9312 mg·mL-1)。

取同一批號樣品(批號20180906，含丁香酚為52.52 mg·g-1)各6份，每份約0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密加入回收對照溶液3 mL，按含量測定的方法制備回收用供試品溶液并測定含量，計算丁香酚的平均回收率為101.2%。結果見表1。

表1 丁香酚加樣回收試驗測定結果

2.2.9 樣品的測定 取20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106共10批樣品，照上述含量測定方法測定丁香酚含量，結果分別為：60、71、52、63、81、62、65、76、87、48mg·g-1。平均值為66.5mg·g-1，最低值為48mg·g-1。

經過上述方法學驗證和耐用性試驗考察，結果表明：本實驗的色譜條件對丁香酚的定量測定專屬性高、重現(xiàn)性好、分離能力強、靈敏度高、操作簡便。

3 討論

3.1 薄層色譜法供試品制備 比較了供試品乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷溶解，以乙酸乙酯為溶劑制備供試品溶液分離度較好，斑點清晰。

3.2 薄層色譜條件選擇 曾采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)、石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)、苯-丙酮(19∶1)等展開劑進行分離，結果表明以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶70∶7)分離效果最好，特征斑點清晰。

3.3 丁香酚含量測定研究 采用GC—MS聯(lián)用技術，比僅采用氣相色譜法測定含量提高了可靠性和準確性。分別比較了正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚(30～60 ℃)為提取溶劑的丁香酚含量結果，結果表明：以乙酸乙酯作為供試液溶劑，樣品中丁香酚溶解完全，測得含量較高，故最終選用乙酸乙酯為溶劑。

3.4 氣相色譜法耐用性考察 采用不同的進樣口溫度(210 ℃、220 ℃、230 ℃)、不同的檢測器溫度(230 ℃、240 ℃、250 ℃)和不同的柱溫(70 ℃、80 ℃、90 ℃)及不同品牌和長度的色譜柱(TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 μm和HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 μm)進行耐用性試驗考察。結果表明，在不同的進樣口溫度、不同的檢測器溫度、不同的柱溫及不同品牌的色譜柱的小范圍變動情況下具有耐用性，均可準確檢出丁香酚。

豬毛蒿精油中有較高含量的抑菌有效成分丁香酚，廣泛應用于臨床及工業(yè)化中藥制劑的生產，因此，建立豬毛蒿精油的質量標準，有效控制精油質量顯得尤為重要，筆者的研究結果為制定其質量標準提供了科學依據。