朱靜靜，周曉龍，汪涵，李向臣，趙阿勇，楊松柏

靶向豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的microRNAs預(yù)測與驗證

朱靜靜，周曉龍，汪涵，李向臣，趙阿勇，楊松柏

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院/浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點實驗室，浙江臨安 311300）

【】預(yù)測并驗證靶向豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中關(guān)鍵基因的microRNAs（miRNAs），為進(jìn)一步研究miRNAs對豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。首先利用偽狂犬病毒（PRV）感染豬腎上皮（PK15）細(xì)胞，高通量測序檢測差異表達(dá)的miRNAs。然后通過TargetScan預(yù)測靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因、、、、的miRNAs。構(gòu)建含有候選miRNAs作用位點的雙熒光素酶報告基因重組載體，并分別與miRNA-mimics共轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎（BHK-21）細(xì)胞，通過測定熒光素酶活性來驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因與候選miRNAs的靶標(biāo)關(guān)系。然后在PK15細(xì)胞中分別過表達(dá)候選miRNAs，利用qRT-PCR和Western blot檢測候選miRNAs對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響。miRNA測序結(jié)果顯示，PRV感染后共引起35條miRNAs差異表達(dá)。TargetScan預(yù)測顯示，靶向、、、、的交集miRNAs為miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p，并將這些交集miRNAs作為候選miRNAs。隨后成功構(gòu)建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK- 2-XBP1-m142/ 145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR雙熒光素酶報告基因載體。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，miR-142-5p顯著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR熒光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分別與miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/ 150/199-3′UTR分別與miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，過表達(dá)組的熒光素酶活性均極顯著低于陰性對照組。同時miR-145-5p能夠顯著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/ 150-3′UTR熒光素酶活性。這些結(jié)果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分別靶向、、，而其中miR-142-5p可能同時靶向這三個關(guān)鍵基因調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路。通過qRT- PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-142-5p后顯著抑制的mRNA和蛋白表達(dá)，表明miR- 142-5p靶向參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。驗證了靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因的miRNA- miR-142-5p，為進(jìn)一步研究miR-142-5p通過調(diào)控的表達(dá)而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路奠定了基礎(chǔ)。

豬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路；miRNA；

0 引言

【研究意義】豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強(qiáng)或持續(xù)時間過長會導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程，因此，從不同角度深入研究豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路至關(guān)重要。本研究通過生物信息學(xué)和試驗方法預(yù)測和驗證靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因的miRNAs，對進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由細(xì)胞內(nèi)膜構(gòu)成的網(wǎng)膜系統(tǒng)，主要參與蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、以及脂質(zhì)和類固醇合成[1-2]。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性和外源性刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會發(fā)生未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白累積，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[3]。在ERS過程中，細(xì)胞會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答措施，激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），減少未折疊蛋白的積累，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動UPR受到ATF6、IRE1、PERK三條信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控[5]。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATF6、IRE1、PERK跨膜蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)感受器葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，UPR處于失活狀態(tài)。當(dāng)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白累積時，GRP78與ATF6、IRE1、PERK解離，并與未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白結(jié)合，激活三種跨膜蛋白，并啟動UPR的ATF6、IRE1、PERK信號通路，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[6-8]。同時，激活的IRE1通過剪切XBP1的mRNA內(nèi)含子，使有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1s表達(dá)，XBP1s能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和蛋白折疊相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊能力[9]。研究表明，一定程度ERS有利于增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)對刺激能力，而過強(qiáng)或持續(xù)的ERS會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，誘導(dǎo)炎癥[10]、細(xì)胞自噬[11]、細(xì)胞凋亡[12]、胰島素抵抗[13]等一系列反應(yīng)的發(fā)生。在豬養(yǎng)殖過程中，病毒感染[14-15]是引起豬ERS的關(guān)鍵因素。本課題組前期研究結(jié)果顯示，PRV感染PK15細(xì)胞后，PRV能夠激活ERS通路[16-17]。miRNA通過抑制靶基因mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶基因mRNA降解，來調(diào)控靶基因的表達(dá)。關(guān)于miRNA靶向調(diào)節(jié)ERS通路的機(jī)制在人類疾病方面已有研究。miR-30d、miR-181a、miR-199a協(xié)同作用能夠有效抑制GRP78表達(dá)水平和GRP78介導(dǎo)的化學(xué)耐藥[18]。miR-145、miR-221和miR-494在支氣管上皮細(xì)胞中調(diào)控ATF6[19]，在小鼠中miR-702也調(diào)控ATF6表達(dá)[20]。參與UPR調(diào)控的miRNA還包括miR-122和miR-30c-2-3p[21-22]。【本研究切入點】隨著高通量miRNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量新的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，靶向不同基因miRNA的預(yù)測和驗證就顯得尤為重要。然而，靶向豬ERS通路的miRNA調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究miRNA對豬ERS通路關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控作用，為后續(xù)從轉(zhuǎn)錄后水平研究調(diào)控ERS的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗于2019年2—8月在浙江農(nóng)林大學(xué)動物遺傳育種與繁殖實驗室完成。

1.1 試驗材料

細(xì)胞和病毒株：PK15細(xì)胞系和BHK-21細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）；PRV（浙江株）由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所張存研究員惠贈。

主要試劑：psiCHECK-2質(zhì)粒、雙熒光素酶檢測試劑盒均購自美國Promega公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ購自美國Thermo公司；miRNA-mimics序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、EasyQuick RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑、BCA試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量試劑SYBR?Primix Ex TaqTMⅡ購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；疏水性PVDF膜購自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉購自美國BD公司；ATF6多克隆抗體購自Abclonal公司；β-Actin購自Proteintech公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自Abbkine公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒接種與miRNA測序 PK15細(xì)胞接種6 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞匯合度80%時接種PRV（TCID50= 10-6.625/0.1 mL）20 μL，同時設(shè)空白細(xì)胞對照（Control）。感染12 h后收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行測序。miRNA測序試驗是由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。利用illumina測序平臺對空白對照和PRV感染的細(xì)胞進(jìn)行測序，分析其miRNAs表達(dá)差異。

1.2.2 靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的miRNA預(yù)測和分析 利用TargetScan（http://www.targetscan.org/）在線預(yù)測和分析靶向、、、、的miRNA，并預(yù)測其3′UTR區(qū)可能的作用位點，通過韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/）取其交集miRNA。miRBase（http://www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫查詢并下載miRNA成熟序列，并分析其保守性。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建 根據(jù)交集miRNA識別并結(jié)合靶基因（Genbank 登錄號：XM_021089515.1）、（Genbank 登錄號：XM_003124925.4）、（Genbank 登錄號：XM_005668695.3）、（Genbank 登錄號：XM_001927795.7）和（Genbank 登錄號：NM_001142836.1）的3'UTR靶點區(qū)域，設(shè)計引物（表1）用于擴(kuò)增包含miRNA靶位點的3′UTR區(qū)。以PK15細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后和psiCHECK-2載體分別用Ⅰ和Ⅰ于37℃雙酶切30min，然后用T4 DNA連接酶于16℃過夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。培養(yǎng)并挑取陽性克隆，送尚亞生物技術(shù)（杭州）有限公司測序。鑒定結(jié)果正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將BHK-21細(xì)胞鋪板至24孔板，細(xì)胞融合至80%左右，利用LipofectamineTM3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照說明書操作，將陰性對照（NC）、miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-150 mimics、miR-199a-5p mimics和雙熒光報告載體共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，用于檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

將PK15細(xì)胞鋪板至6孔板和12孔板，細(xì)胞融合至50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將只加轉(zhuǎn)染試劑空白對照（MOCK）、陰性對照（NC）、miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，共形成5個組合。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，6孔板細(xì)胞用于檢測ATF6的蛋白水平，12孔板用于檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因、、和的mRNA表達(dá)水平。

表1 雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建引物序列

標(biāo)下劃線的序列為Ⅰ和Ⅰ酶切位點 The underlined sequences areⅠ andtⅠ digestion sites

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測 按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書操作。PBS清洗細(xì)胞后，每孔加100 μL 1×Passive Lysis Buffer，放置室溫?fù)u床緩慢搖動15 min。吸取5 μL裂解液至96孔黑色酶標(biāo)板對應(yīng)孔中，再加入25 μL LAR-II試劑，使用多功能酶標(biāo)儀測定螢火蟲熒光素酶的熒光值。然后每孔加入25 μL 1×Stop &Glo終止液，檢測海腎熒光素酶的熒光值。最后以螢火蟲熒光作為內(nèi)參照對結(jié)果進(jìn)行均一化處理。

1.2.6 總RNA提取及cDNA合成 利用Trizol法提取PK15細(xì)胞總RNA，使用分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。以PK15細(xì)胞總RNA作為模板進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系20 μL：5×EasyQuick RT MasterMix 4 μL，RNA1μg，RNase- free ddH2O補(bǔ)足體系，渦旋震蕩混勻，經(jīng)短暫離心，PCR反應(yīng)條件：37℃ 15 min；85℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。

1.2.7 熒光定量引物設(shè)計合成與qRT-PCR反應(yīng) 根據(jù)NCBI已發(fā)表的豬、、、、序列設(shè)計qRT-PCR引物（表2）。以不同處理組的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后分析溶解曲線，采用2-△△Ct法計算、、、的相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blot檢測 利用RIPA細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染后PK15細(xì)胞的總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每組蛋白上樣量相同，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2h。加5%脫脂奶粉稀釋ATF6抗體（1﹕1 000）及β-Actin抗體（1﹕5 000），4℃孵育過夜，1×TBST充分洗膜3次（10 min/次）后，分別加入HRP標(biāo)記的二抗（1﹕10 000），室溫孵育1 h，最后掃描分析目的蛋白條帶。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，每個試驗3個生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計學(xué)分析采用T檢驗，*＜0.05；**＜0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 PRV感染PK15細(xì)胞后miRNA差異表達(dá)分析

由筆者所在課題組前期研究結(jié)果表明PRV感染能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，所以為了檢測PRV感染引起miRNA表達(dá)的變化，用PRV感染PK15細(xì)胞，感染后12 h收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行miRNA測序。結(jié)果表明，PRV感染PK15細(xì)胞后，誘導(dǎo)miRNA差異表達(dá)。與PRV未感染的空白對照組相比，PRV感染后共引起35條miRNAs表達(dá)變化，其中包括27條miRNAs（miR-132、miR-136-3p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-146b、miR-190b、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-212、miR-218、miR-218-5p、miR-218b、miR-323、miR-363、miR-369、miR-375、miR-381-3p、miR-382、miR-551a、miR-758、miR-874、miR-9、miR-9-1、miR-9-2、miR-9820-5p）表達(dá)量上調(diào)，8條miRNAs（miR-10391、miR-2366、miR-27b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-3p、miR-374b-3p、miR-671-3p、miR-885-3p）表達(dá)量下調(diào)（圖1）。結(jié)果表明，PRV感染引起豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)發(fā)生變化。

2.2 靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路關(guān)鍵基因的miRNAs預(yù)測

利用TargetScan生物信息學(xué)軟件，預(yù)測出與、、、、具有靶標(biāo)關(guān)系的miRNAs分別有55、14、52、30和21個。用韋恩圖取交集，miR-150同時靶向、、、、五個基因，miR-142-5p同時靶向、、、基因，miR-145-5p和miR-199a-5p同時靶向、、、基因（圖2）。于是，本研究選擇miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p作為候選miRNAs。

2.3 雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建與鑒定

將、、、、的3′UTR區(qū)插入psiCHECK-2構(gòu)建雙熒光報告載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，培養(yǎng)并挑取單克隆，送去公司測序。鑒定結(jié)果正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證（圖3）。最終獲得重組正確的雙熒光報告載體分別命名為psiCHECK-2-ATF6- m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK- 2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150- 3′UTR、psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR。

2.4 熒光素酶報告基因活性檢測

為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p能夠靶向作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路關(guān)鍵基因，將重組質(zhì)粒分別與miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-150 mimics和miR-199a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，24 h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR與miR-142- 5p mimics后，過表達(dá)組的熒光素酶活性極顯著低于陰性對照組（圖4-A）。同時，psiCHECK-2-IRE1-m142/ 145/199-3′UTR分別與miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，過表達(dá)組的熒光素酶活性極顯著低于陰性對照組（圖4-B），以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR分別與miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，過表達(dá)組的熒光素酶活性也極顯著低于陰性對照組（圖4-C）。共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR與miR-145-5p mimics，能夠顯著下調(diào)熒光素酶報告基因的表達(dá)（圖4-D）。結(jié)果表明，miR-142-5p與、、的3′UTR靶位點結(jié)合，miR-199a-5p與、的3′UTR靶位點結(jié)合，以及miR-145-5p與、的3′UTR靶位點結(jié)合，從而抑制了熒光信號的產(chǎn)生。

圖1 PRV感染PK15細(xì)胞miRNA測序數(shù)據(jù)火山圖

圖2 與ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1具有靶標(biāo)關(guān)系的miRNAs交集預(yù)測

M：DL2000 Marker；1：psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR，2：psiCHECK- 2-ATF6-m145-3′UTR，3：psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR，4：psiCHECK- 2-ATF6-m199-3′UTR，5：psiCHECK-2-IRE1-m150-3′UTR，6：psiCHECK- 2-IRE1-m142/145/199-3′UTR，7：psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR，8：psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR，9：psiCHECK-2-GRP78- m145/199-3′UTR

圖4 miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-150 mimics和miR-199a-5p mimics對重組載體熒光素酶表達(dá)的影響

2.5 qRT-PCR分析

根據(jù)熒光素酶報告系統(tǒng)篩選結(jié)果，利用qRT-PCR試驗來進(jìn)一步驗證。將空白對照（MOCK）、陰性對照（NC）、miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測、、和的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-142-5p后，的表達(dá)量顯著低于陰性對照組和空白對照組（＜0.05，圖5-A）。說明miR-142-5p負(fù)調(diào)控的表達(dá)。而miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p過表達(dá)后，極顯著上調(diào)mRNA表達(dá)（＜0.01，圖5-B）。同樣，過表達(dá)miR-142-5p和miR-199a-5p后，的mRNA表達(dá)也顯著上調(diào)（＜0.05，圖5-C）。

2.6 過表達(dá)miR-142-5p對ATF6蛋白表達(dá)的影響

過表達(dá)miR-142-5p后，ATF6蛋白的表達(dá)情況見圖6。結(jié)果顯示，過表達(dá)組中ATF6的表達(dá)量顯著低于陰性對照組和空白對照組。結(jié)果表明，miR-142-5p與ATF6靶位點結(jié)合后，抑制ATF6蛋白的表達(dá)。

3 討論

3.1 miRNA測序分析

miRNA是一類18—25 bp的調(diào)節(jié)性非編碼RNA，主要通過部分堿基互補(bǔ)配對方式將其種子序列與靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)參與多種重要生理過程。大量研究表明，miRNA在調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因中發(fā)揮重要作用[18-22]，但是大部分報道都集中在人和小鼠等哺乳動物的研究上，對豬miRNA的研究尚未報道。因此，開展內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)miRNA的研究，為從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路從而調(diào)控PRV感染奠定理論基礎(chǔ)。

圖5 過表達(dá)miRNAs后ATF6、IRE1、XBP1和PERK mRNA的表達(dá)量

A.轉(zhuǎn)染miR-142-5p mimics后，PK15細(xì)胞中ATF6蛋白Western blotting檢測；B.轉(zhuǎn)染miR-142-5p mimics后，PK15細(xì)胞中ATF6蛋白相對表達(dá)量檢測

本課題組前期研究結(jié)果顯示PRV感染激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。本研究首先利用高通量測序方法發(fā)現(xiàn)PRV感染PK15細(xì)胞后引起35條miRNAs差異表達(dá)，其中包括miR-132、miR-142-5p、miR-199a-5p、miR-374b-3p、miR-382和miR-874。研究表明PRV感染后引起miR-132、miR-199a/b-3p和mir-374b-3p等13條miRNAs在宿主細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)，同時通過GO富集分析差異表達(dá)miRNAs潛在的宿主靶基因，發(fā)現(xiàn)這些靶基因參與生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等信號傳導(dǎo)過程[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，CSFV感染PK15細(xì)胞后引起miR-382和miR-874等69條miRNAs表達(dá)變化[24]。推測PRV感染引起豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，宿主miRNA靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因，從而參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。

3.2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析

本研究中，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵基因、、、、具有靶標(biāo)關(guān)系的miRNAs，發(fā)現(xiàn)與、、、、中至少4個基因具有靶標(biāo)關(guān)系的miRNAs，分別是miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150、miR-199a-5p。其中miR-142-5p和miR-199a-5p在miRNA測序結(jié)果中也顯示為差異表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ERS傳導(dǎo)器IRE1通過下調(diào)miR-150介導(dǎo)纖維化，同時IRE1促進(jìn)XBP1剪接進(jìn)而激活肌成纖維細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張[25]。此外，面對各種環(huán)境應(yīng)激，miRNA成為應(yīng)激后免疫修飾的靶點。miR-142-5p、miR--150在熱應(yīng)激大鼠中差異表達(dá)，調(diào)控參與大鼠小腸熱應(yīng)激病理及生理反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)[26]。HPV感染細(xì)胞后下調(diào)miR-145表達(dá)，低表達(dá)的miR-145使細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[27]。有研究表明，在人肺腺癌細(xì)胞中，miR-199a-5p通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄本使基因表達(dá)水平顯著下調(diào)[28]。因此推測，miR-142、miR-145、miR-150、miR-199可能在豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。

3.3 候選miRNAs對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

根據(jù)miRNA預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建了雙熒光素酶報告基因重組載體，并利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證發(fā)現(xiàn)miR-142-5p mimics顯著抑制psiCHECK-2-ATF6- m142-3′UTR重組載體熒光素酶活性。同時qRT-PCR和Western blot試驗再次驗證了這一結(jié)果，過表達(dá)miR-142-5p后，的mRNA水平和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。表明miR-142-5p通過降解mRNA的方式靶向豬。針對靶向人的miRNA研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在UPR過程中，PERK介導(dǎo)的miR-424與的3′UTR區(qū)作用位點結(jié)合調(diào)節(jié)的表達(dá)，并減弱ATF6轉(zhuǎn)錄活性[29]，miR-145、miR-221和miR-494可以靶向的3′UTR區(qū)進(jìn)而抑制囊性纖維化中表達(dá)[19]。而本研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p并不靶向豬，具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

本研究中，miR-142-5p、miR-199a-5p均與、的3′UTR靶位點結(jié)合，從而抑制了熒光素酶活性。但qRT-PCR結(jié)果顯示，和的mRNA表達(dá)水平并未下調(diào)，而且顯著上調(diào)，可能是由于miR-142-5p和miR-199a-5p同時激活相關(guān)信號通路從而上調(diào)和表達(dá)，如miR-142-5p同時能夠激活UPR的ATF6信號傳導(dǎo)通路，ATF6可以協(xié)同IRE1信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)的mRNA轉(zhuǎn)錄[30]。研究表明，miR-30d、miR-181a和miR-199a-5p三條miRNAs共轉(zhuǎn)錄能夠明顯降低表達(dá)，三條miRNAs的聯(lián)合作用可能是實現(xiàn)顯著下調(diào)的關(guān)鍵[18]。本研究中雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，單獨miR-199a-5p并不靶向豬3′UTR。據(jù)此推測可能需要多個miRNAs才能有效調(diào)控的表達(dá)。

以上結(jié)果表明，miR-142-5p可能靶向達(dá)到調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的作用。

4 結(jié)論

本研究通過miRNA測序發(fā)現(xiàn)，偽狂犬病毒感染誘導(dǎo)miR-142-5p表達(dá)上調(diào)，同時，miR-142-5p通過降解mRNA的方式靶向豬，因此推測miR-142-5p通過靶向調(diào)控偽狂犬病毒增殖。

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Prediction and Verification of MicroRNAs Targeting Porcine Endoplasmic Reticulum Stress Pathway

ZHU JingJing, ZHOU XiaoLong, WANG Han, LI XiangChen, ZHAO AYong, YANG SongBai

(College of Animal Science and Technology, Zhejiang A&F University/Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Lin’an 311300, Zhejiang)

【】 This study was aimed to predict and validate microRNAs (miRNAs) that targeting key genes in the porcine endoplasmic reticulum (ER) stress pathway, so as to provide a theoretical basis for regulation of porcine ER stress signaling pathway by miRNAs.【】 Firstly, the differential expression of miRNAs in PRV-infected PK15 cells in porcine ER were determined by high-throughput sequencing. TargetScan was used to predict miRNAs that targeting the genes,,,, andof ER stress pathways. Recombinant plasmids were constructed, including candidate miRNA target sites, and the regulation of,,,, andby candidate miRNAs was validated by co-transfecting dual-luciferase reporter gene vector construct with miRNA-mimics into BHK-21 cells.Then, the candidate miRNAs were over-expressed in PK15 cells, and then fluorescent quantitative PCR and Western blot were used to detect the effect of miRNAs on key genes expression at mRNA and protein levels. 【】 MiRNA sequencing results showed that 35 differential expression of miRNAs were determined in PRV-infected PK15 cells. The results of TargetScan prediction showed that the intersection of miRNAs targeting four or more genes of,,,, andwere miR-142-5p, miR-145-5p, miR-150, and miR-199a-5p, and these intersections of miRNAs were selected as candidate miRNAs. The dual-luciferase reporter plasmids psiCHECK-2-ATF6-m142-3'UTR, psiCHECK- 2-ATF6-m145-3'UTR, psiCHECK-2-ATF6-m150-3'UTR, psiCHECK-2-ATF6-m199-3'UTR, psiCHECK-2-IRE1-m150-3'UTR, psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3'UTR, psiCHECK-2-PERK-m145/150-3'UTR, psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199- 3'UTR, psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3'UTR were successfully constructed. The luciferase assay experiments showed that miR-142-5p mimics could significantly inhibit luciferase activity of psiCHECK-2-ATF6-m142-3'UTR dual-luciferase reporter recombinant vector. psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3'UTR was co-transfected with miR-142-5p mimics, miR-145-5p mimics, and miR-199a-5p mimics, respectively. The luciferase activity of the over-expressing group were significantly lower than the negative control group. In addition, psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3'UTR was co-transfected with miR-142-5p mimics and miR-199a-5p mimics, respectively, and the luciferase activity of the over-expressing group were also significantly lower than the negative control group.The luciferase assay experiments showed that miR-145-5p mimics could significantly inhibit luciferase activity of psiCHECK-2- PERK-m145/150-3'UTR dual-luciferase reporter recombinant vector. The results indicated that miR-142-5p, miR-145-5p and miR-199a-5p might targeted the genes,, and.Among them, miR-142-5p might target these three key genes to regulate the ER signaling pathway.Overexpression of miR-142-5p significantly down-regulated the levels of mRNA and protein by qRT-PCR and Western blot methods. The results showed that miR-142-5p might participate in the regulation of ER signaling pathway by targeting.【】 In this study, miR-142-5p was validated to target the key geneof the porcine ER stress pathway. Thereby, these results laid a foundation for further study of regulation of ER stress pathway through miR-142- 5pgene axis.

pig; endoplasmic reticulum stress signaling pathway; miRNA;

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.016

2019-08-30；

2020-03-11

浙江省自然科學(xué)基金（LY19C170002）

朱靜靜，E-mail：2018120012009@stu.zafu.edu.cn。通信作者楊松柏，E-mail：sbyang@zafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）