余愛麗，趙晉鋒，成鍇，王振華，張鵬，劉鑫，田崗，趙太存，王玉文

谷子萌發(fā)吸水期關鍵代謝途徑的篩選與分析

余愛麗，趙晉鋒，成鍇，王振華，張鵬，劉鑫，田崗，趙太存，王玉文

（山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所，山西長治 046011）

【】谷子適應性強，抗旱耐瘠，是起源于中國的重要作物。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術分析谷子萌發(fā)不同吸水期的轉(zhuǎn)錄組差異，以期獲得谷子萌發(fā)過程中的差異表達基因，尋找調(diào)控谷子萌發(fā)的重要代謝途徑和代謝物。以晉谷20為材料，構建谷子萌發(fā)過程中開始快速吸水期、滯緩吸水期和重新大量吸水期的cDNA文庫，進行轉(zhuǎn)錄組分析；采用K-Means開展基因表達聚類分析；利用DESeq篩選差異表達基因；通過COG、GO、KEGG等對差異表達基因進行功能注釋；利用KEGG富集挖掘不同吸水期調(diào)控種子萌發(fā)的關鍵代謝途徑和關鍵基因；并采用qRT-PCR驗證其可靠性；用HPLC分析關鍵代謝物含量。轉(zhuǎn)錄物測序分析獲得谷子萌發(fā)開始快速吸水期、滯緩吸水期和重新大量吸水期覆蓋整個基因組的基因表達譜，共獲得33 643個基因，識別9個具有不同表達模式的共表達基因簇。比較種子萌發(fā)的開始快速吸水期與滯緩吸水期、滯緩吸水期與重新大量吸水期、開始快速吸水期與重新大量吸水期，分別篩選出3 893、4 612和8 472個差異表達基因。KEGG富集分析表明，3個比較的差異表達基因都顯著富集到phenylpropanoid biosynthesis、phenylalanine metabolism、starch and sucrose metabolism代謝途徑；開始快速吸水期與滯緩吸水期、開始快速吸水期與重新大量吸水期的差異表達基因還顯著富集到plant hormone signal transduction途徑。并且3個比較中富集到phenylpropanoid biosynthesis和phenylalanine metabolism代謝途徑的差異表達基因數(shù)都最多，其中過氧化物酶基因（）比例最高。通過qRT-PCR對4個苯丙烷生物合成途徑相關基因的分析表明，其表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析結果基本一致，其中，4-香豆酸-CoA連接酶3（4-coumarate-CoA ligase 3）在谷子種子中存在已形成mRNA，萌發(fā)吸水過程中呈先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的表達趨勢。苯丙烷類相關代謝物含量分析顯示，芥子酸在種子中大量儲備，在萌發(fā)過程中呈下調(diào)趨勢；阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸呈先上調(diào)后下調(diào)趨勢。谷子萌發(fā)過程中，不同吸水期的差異表達基因顯著與苯丙烷生物合成途徑和苯丙氨酸代謝途徑相關；其上游基因4-香豆酰-輔酶A連接酶和下游基因過氧化物酶家族成員在谷子萌發(fā)響應水分過程中發(fā)揮調(diào)控作用；中間產(chǎn)物芥子酸可能參與種子的休眠與萌發(fā)。

谷子；種子萌發(fā)吸水期；轉(zhuǎn)錄物組分析；苯丙烷生物合成途徑；苯丙氨酸代謝途徑

0 引言

【研究意義】谷子為小粒作物，千粒重僅3 g左右，播種深度只有3—5㎝。在各種復雜多變氣候土壤條件下，谷子種植常面臨播種難、萌發(fā)出苗難、保苗難、苗不全等問題。種子萌發(fā)起始于干燥種子水分的吸收，涉及一系列形態(tài)結構、生理生化和分子水平的變化，并長成具有正常構造幼苗，其中，對水分的吸收與響應是植物生長周期起始的關鍵。因此，研究谷子萌發(fā)過程中不同吸水期的各種變化和調(diào)節(jié)機制，將有助于調(diào)控谷子萌發(fā)，提高出苗率和全苗率，并為谷子種子引發(fā)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】種子萌發(fā)是植物生長周期的起點，也是農(nóng)作物種植生產(chǎn)的開始。狹義的種子萌發(fā)，起始于水的吸收，終止于胚軸的延伸，以胚根突破種皮為萌發(fā)結束的標志[1]。廣義的種子萌發(fā)，是指種胚恢復生長直至長成具有正常構造幼苗的過程，包括吸脹、萌動、發(fā)芽和幼苗形態(tài)建成[2]。種子萌發(fā)過程中水分吸收大致分為3個階段：第一階段開始快速吸水期；第二階段滯緩吸水期；第三階段重新大量吸水期。其中，涉及呼吸、可溶物的滲漏、以現(xiàn)存和新mRNA為模板的蛋白質(zhì)合成起始、DNA修復、線粒體的修復和合成、細胞分化和DNA合成等過程[3]。目前，谷子萌發(fā)期的相關研究主要側(cè)重于抗旱性鑒定、不同逆境的生理響應。如張錦鵬等[4]利用甘露醇為脅迫劑，以5個谷子品種為材料，開展了萌發(fā)期人工模擬脅迫谷子耐旱性的鑒定。朱學海[5]采用PEG-6000、甘露醇2種滲透劑模擬水分脅迫，確定了鑒定谷子芽期耐旱性的PEG-6000和甘露醇脅迫條件分別為-0.75和-1.00 MPa，種子萌發(fā)耐旱指數(shù)與相對根長宜作為谷子芽期耐旱性鑒定指標。秦嶺等[6]鑒定了201份不同生態(tài)區(qū)主要育成谷子品種芽期耐旱性。2018年印度學者Bheemesh等[7]采用4種不同濃度的PEG對60個谷子品種進行萌發(fā)期干旱脅迫處理，篩選出4個高耐受性谷子品種。逆境生理響應方面，王春梅等[8]分析了不同濃度砷對谷子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)As＜4 mg·kg-1促進谷子萌發(fā)，高濃度（As≥4 mg·kg-1）抑制谷子萌發(fā)。裴帥帥等[9]研究了晉谷28、晉谷45、晉谷42和晉谷77-322萌發(fā)期對干旱脅迫的生理響應，結果表明，在18% PEG的脅迫下，谷子的可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量都有所升高，差異較顯著。其中，晉谷45的脯氨酸含量、蛋白質(zhì)含量、SOD和POD活性比對照分別提高462.34%、34.17%、113.84%和61.22%；晉谷28的MDA含量增幅最小，晉谷42增幅最大，比CK增加98.7%。楊凈等[10]研究超重力對谷子種子萌發(fā)及生理生化特性的影響，結果表明，中低速離心處理促進種子萌發(fā)，增加了根長及鮮重，減小了芽長，降低了丙二醛含量，提高了SOD活性，除3 000 r/min離心60 min處理外，都提高了POD活性。谷子萌發(fā)期分子機理研究較少，2017年，Tang等[11]分析了干旱脅迫下抗、感谷子在生理和轉(zhuǎn)錄水平上的差異，鑒定出20個與苗期和萌發(fā)期抗旱相關的QTL。竇祎凝等[12]通過反向遺傳學方法研究表明，谷子轉(zhuǎn)錄因子SiNAC18通過ABA信號途徑正向調(diào)控干旱條件下的種子萌發(fā)。2018年，許冰霞等[13]對萌發(fā)10和18 h種子的對照組和PEG處理組構建cDNA文庫并進行差異表達基因的表達譜分析，分別篩選出456和545個差異表達基因，其中87和267個上調(diào)表達基因，369和278個下調(diào)表達基因；KEGG富集分析表明，差異表達基因參與到苯丙烷生物合成途徑和植物激素信號轉(zhuǎn)導過程；苯丙烷生物合成途徑的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（CA4H）基因在谷子萌發(fā)10和18 h均發(fā)生了下調(diào)表達。2019年，潘教文等[14]分析了鹽條件下培養(yǎng)7 d，去掉胚根胚芽萌發(fā)種子的轉(zhuǎn)錄物組，發(fā)現(xiàn)NaCl處理下DEGs主要集中在脅迫響應、氧化還原、離子的跨膜轉(zhuǎn)運、多胺、有機酸、苯丙烷的合成等過程。苯丙烷生物合成途徑（phenylpropanoid biosynthesis）的上游為苯丙氨酸代謝途徑（phenylalanine metabolism），其為苯丙烷類合成提供前體[15]。苯丙烷生物合成途徑可形成一系列間產(chǎn)物，如反式肉桂酸、香豆酸等，也可進一步轉(zhuǎn)化成香豆素、綠原酸、類黃酮、異黃酮、花青素、植物激素、木質(zhì)素等[16-17]。苯丙烷類代謝物是植物特有的，在植物生長、發(fā)育、與環(huán)境互作過程中發(fā)揮重要作用[18-19]；也可作為調(diào)節(jié)分子，在植物防御病原物、抵御捕食者、信號轉(zhuǎn)導與其他生物互作過程中發(fā)揮重要作用[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對谷子萌發(fā)期主要側(cè)重于干旱、鹽等逆境脅迫條件下的萌發(fā)率、形態(tài)結構、生理生化和轉(zhuǎn)錄譜研究，但對谷子不同萌發(fā)吸水期的轉(zhuǎn)錄組和代謝物變化及其調(diào)控機理鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用轉(zhuǎn)錄組分析方法探尋谷子在快速吸水期、滯緩吸水期、和重新大量吸水期的差異表達基因和關鍵代謝途徑，分析重要代謝物的含量變化，從轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平探討谷子萌發(fā)吸水的調(diào)控機理，為調(diào)節(jié)和引發(fā)谷子萌發(fā)，提高出苗率的技術創(chuàng)制提供可借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

篩選成熟度好、大小均一的晉谷20為試驗材料。用3% NaClO浸泡消毒20 min，其間不斷混勻，開蓋透氣，然后用蒸餾水沖洗4—5次（合計20 min），均勻播種于已鋪放3層發(fā)芽紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿50粒，加入蒸餾水7 ml。放置于溫度24℃—26℃，相對濕度40%—50%培養(yǎng)室中培養(yǎng)。每個取樣時間點設3次重復，共重復2輪。依據(jù)已經(jīng)繪制的相同試驗條件和試驗材料的種子萌發(fā)吸水規(guī)律圖，選取吸水3和5 h收集開始快速吸水期樣品，混合，兩輪分別標記為CK2和CK2R；收集吸水9和11 h滯緩吸水期樣品，混合，兩輪分別標記為CK8和CK8R；采集吸水15和17 h重新大量吸水期樣品，混合，兩輪分別標記為CK14和CK14R；液氮速凍，-80℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。相應的開始快速吸水期、滯緩吸水期和重新大量吸水期，分別用PhaseⅠ、PhaseⅡ、PhaseⅢ表示。另外，于相同條件下，培養(yǎng)和收集吸水0、2、3、5、8、9、11、14、15和17 h的萌發(fā)種子，液氮速凍-80℃保存，用于基因表達定量分析和代謝物含量分析。

1.2 總RNA的提取和檢測

采用CTAB法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳進行初步檢測。由NanoPhotometer? spectrophotometer（IMPLEN, CA, USA）檢測RNA的純度，Agilent Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies, CA, USA）分析RNA的完整度。合格的RNA進行cDNA文庫構建。

1.3 cDNA文庫的構建及測序

cDNA文庫的構建和測序由中國北京百邁客公司完成。每個樣品取1 μg RNA，采用試劑盒NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina?（NEB, USA），依據(jù)其說明書，用AMPure XP system（Beckman Coulter, Beverly, USA）純化的200—250 bp片段，構建cDNA文庫。用Illumina Hiseq 2500開展高通量轉(zhuǎn)錄組測序。共進行6個樣本的高通量測序建庫。

1.4 基因表達分析及功能注釋

1.4.1 基因表達分析 采用Tophat2[22]將樣品的Clean reads與參考基因組進行序列比對。利用FPKM[23]值來反應基因的表達豐度。將皮爾遜相關系數(shù)（Pearson’s Correlation Coefficient）作為生物學重復相關性的評估指標[24]，分析3個不同吸水階段的相關性。通過K-Means方法進行基因表達聚類分析。

1.4.2 差異表達基因分析 采用DESeq[25]進行差異表達分析，然后采用Benjamini-Hochberg方法對差異顯著性-values進行校正。用Fold Change≥2且FDR（false discovery rate）＜0.01作為標準，篩選差異表達基因。開始快速吸水期和滯緩吸水期比較、滯緩吸水期與重新大量吸水期比較、開始快速吸水期與重新大量吸水期比較分別表示為PhaseⅠ-PhaseⅡ、PhaseⅡ-PhaseⅢ和PhaseⅠ-PhaseⅢ。

1.4.3 功能注釋 依據(jù)NR（NCBI non-redundant protein sequences）[26]、Swiss-Prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database）[27]、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[28]、COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）[29]和GO（Gene Ontology）[30]在線數(shù)據(jù)庫，對獲得的差異表達基因進行功能注釋。并進行差異表達基因的GO富集和KEGG通路富集。利用topGO[31]軟件展示富集的GO節(jié)點（Term）及其層級關系，然后用ReviGO[32]對富集GO term去冗余和進一步聚類。

1.5 實時熒光定量PCR分析

選取關鍵代謝途徑的4個差異表達基因，用實時熒光定量技術驗證轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)的可靠性。通過CTAB法提取樣品總RNA，使用熒光定量SYBR試劑盒（TaKaRa）和Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa Code.TP800）進行試驗。擴增體系為12.5 μL SYBR、1 μL引物（10 μmol·L-1）、8.5 μL無菌蒸餾水和2 μL的cDNA模板。擴增程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。各基因特異引物具體見表1。以谷子組成型表達基因（Seita.7G294000）作為內(nèi)參基因。采用雙標準曲線法計算基因的相對表達量[33]，每個樣品設3個技術重復。

1.6 苯丙烷類關鍵代謝物含量分析

采用HPLC方法[34]，分析不同萌發(fā)時期谷子中的肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量變化。

表1 苯丙烷類相關基因qRT-PCR表達分析引物

2 結果

2.1 谷子萌發(fā)3個吸水階段轉(zhuǎn)錄物組分析

采用高通量測序方法分析3個吸水階段的6個混合樣品的轉(zhuǎn)錄物組。去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和接頭序列，共獲得34.51 Gb Clean bases，各樣品Clean bases均達到4.89 Gb以上，堿基質(zhì)量值Q30在85.13%及以上。與谷子參考基因組進行序列比對，比對效率為79.47%—81.57%（表2）。開始快速吸水期樣本CK2和CK2R分別含有4.89和4.98 Gb的Clean bases，滯緩吸水期樣本CK8和CK8R含有7.07和5.47 Gb的Clean bases，重新大量吸水期樣本CK14和CK14R含有5.90和6.17 Gb的Clean bases。3個不同萌發(fā)吸水階段的相關性分析結果表明，開始快速吸水期和滯緩吸水期的相關性為0.73—0.76，開始快速吸水期與重新大量吸水期的相關性為0.32—0.34；滯緩吸水期與重新大量吸水期的相關性為0.65—0.69，說明不同吸水階段涉及大量不同基因和代謝途徑。

表2 測序結果及其與參考基因組比對分析

依據(jù)RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）來反映基因的表達豐度，共獲得33 643個基因。以RPKM≥0.01為篩選標準，開始快速吸水期樣本CK2和CK2R分別含29 181和27 026個基因，滯緩吸水期樣本CK8和CK8R分別含27 655和26 247個基因，重新大量吸水期樣本CK14和CK14R有28 666和26 864個基因。以K-Means方法分析基因表達規(guī)律，共識別9個不同表達模式的基因簇（圖1-A）。其中基因簇3含227個基因，從開始快速吸水期，經(jīng)滯緩吸水期，到重新大量吸水期，基因表達量顯著下降；而基因簇4含281個基因，從開始快速吸水期至重新大量吸水期，基因表達量顯著上調(diào)，表明這些基因在谷子種子吸水萌發(fā)過程中具有不同的作用。同時以各基因簇的各個時期的所有樣品的RPKM平均值為依據(jù)進行聚類分析，結果表明，1、3、5、9基因簇聚為一大簇，基因表達呈下調(diào)趨勢，2、4、6、7和8基因簇聚成另一簇，基因表達呈上調(diào)趨勢（圖1-B）。

2.2 谷子萌發(fā)3個吸水階段的差異表達基因分析

將Fold Change≥2和FDR＜0.01作為篩選標準，對不同吸水階段比較結果進行差異表達基因篩選，開始快速吸水期與滯緩吸水期比較（PhaseⅠ-PhaseⅡ）識別了3 893個差異表達基因，滯緩吸水期與重新大量吸水期之間（PhaseⅡ-PhaseⅢ）有4 612個差異表達基因，開始快速吸水期與重新大量吸水期比較（PhaseⅠ-PhaseⅢ）中識別8 472個差異表達基因（圖2）。3個比較之間共有差異表達基因1 277個，占所有差異表達基因的13.3%，其中，共有上調(diào)基因625個，下調(diào)基因642個。PhaseⅠ-PhaseⅢ和PhaseⅡ-PhaseⅢ的差異表達基因的數(shù)量大于PhaseⅠ-PhaseⅡ，表明在重新大量吸水期中存在大量復雜的與谷子萌發(fā)發(fā)育相關的合成代謝途徑（圖2）。并且火山圖（圖3）也直觀整體地展示基因在各比較的2個時期之間表達水平存在顯著差異，在開始快速吸水期與重新大量吸水期比較中差異倍數(shù)大的基因最多。

2.3 差異表達基因功能的注釋和富集分析

依據(jù)數(shù)據(jù)庫COG、GO和KEGG，對3個比較的差異表達基因進行功能注釋、分類和富集。COG分類結果表明，開始快速吸水期和滯緩吸水期比較、滯緩吸水期與重新大量吸水期比較、開始快速吸水期與重新大量吸水期比較的差異表達基因歸屬最多的功能類別為碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝（carbohydrate transport and metabolism）、轉(zhuǎn)錄（transcription）、復制重組和修復（replication，recombination and repair）、一般功能（general function prediction only）、信號轉(zhuǎn)導機制（signal transduction mechanism）。PhaseⅠ-PhaseⅢ還包括翻譯核糖體結構和生物合成（translation，ribosomal structure and biogenesis）、翻譯后修飾蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶（posttranslation modification，protein turnover，chaperones）。

將3個不同吸水期間差異表達基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫并進行功能分類，結果顯示，PhaseⅠ-PhaseⅡ、PhaseⅡ-PhaseⅢ和PhaseⅠ-PhaseⅢ分別注釋到生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組分（cellular component）的差異表達基因分別有2 028、1 182和330，2 082、1 219和335，2 498、1 572和434個。對比較間差異表達基因進行GO富集分析，以校正-value≤0.01為標準篩選富集到的Term，結果顯示，PhaseⅠ-PhaseⅡ、PhaseⅡ-PhaseⅢ和PhaseⅠ-PhaseⅢ分別注釋到生物過程、細胞組分和分子功能的26、15和7，29、10和6，23、14和6個通路。對所有篩選到的富集Term進行分析，結果表明，3個比較共同富集至7個通路，反應于寒冷、缺水、缺氧、干枯、氧化壓力、karrikin通路和油菜素類固醇生物合成過程；開始快速吸水期和滯緩吸水期比較特有10個通路；滯緩吸水期與重新大量吸水期比較特有12個通路；開始快速吸水期與重新大量吸水期比較特有3個通路。3個比較的GO富集結果經(jīng)軟件ReviGO去冗余和進一步聚類后，結果表明，PhaseⅠ-PhaseⅡ主要涉及對油菜素內(nèi)脂的反應（response to brassinosteroid）、根毛伸長（root hair elongation）、甾醇生物合成（sterol biosynthesis）和水轉(zhuǎn)運（water transport）4個通路；PhaseⅡ-PhaseⅢ主要集中氮的轉(zhuǎn)運（nitrate transport）、油菜素類固醇生物合成（brassinosteroid biosynthesis）、真菌防御反應（defense response to fungus）、乙酰輔酶A代謝（acetyl-CoA metabolis）和細胞板形成引起的細胞分裂（cytokinesis by cell plate formation）通路；PhaseⅠ-PhaseⅢ主要與冷反應（response to cold）、植物型細胞壁松弛（plant-type cell wall loosening）、油菜素類固醇生物合成（brassinosteroid biosynthesis）、根毛伸長（root hair elongation）、DNA復制起始（DNA replication initiation）有關。可見在谷子萌發(fā)的不同吸水階段啟動了大量代謝通路，并且各有不同，過程非常復雜。

A：具有不同表達模式的9個基因簇，縱坐標表示中心化的基因表達量的對數(shù)值；B：9個基因簇基因表達熱圖

A：所有差異表達基因；B：上調(diào)差異表達基因；C：下調(diào)差異表達基因 A: All of DEGs; B: Up-regulated DEGs; C: Down-regulated DEGs

橫坐標表示某一個基因在兩樣品中表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值；縱坐標表示基因表達量變化的統(tǒng)計學顯著性的負對數(shù)值

差異表達基因KEGG通路注釋結果顯示，開始快速吸水期和滯緩吸水期比較涉及111代謝通路，其中，苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）分別有64個和80個差異表達基因，植物激素信號轉(zhuǎn)導（plant hormone signal transduction）通路含65個差異表達基因，淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）通路含56個。滯緩吸水期與重新大量吸水期比較的差異表達基因注釋到117代謝通路，其中phenylalanine metabolism和phenylpropanoid biosynthesis分別有78個和106個差異表達基因，plant hormone signal transduction通路含54個差異表達基因，starch and sucrose metabolism通路含54個，碳代謝（Carbon metabolism）有55個差異表達基因。開始快速吸水期與重新大量吸水期比較涉及120代謝通路，其中phenylalanine metabolism和phenylpropanoid biosynthesis分別有105個和134個差異表達基因，plant hormone signal transduction通路含110個差異表達基因，starch and sucrose metabolism通路含93個，氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）和carbon metabolism分別有86和83個，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工（protein processing in endoplasmic reticulum）含72個。

KEGG富集結果進一步表明（圖4），3個比較的差異表達基因全部顯著富集于phenylalanine metabolism和phenylpropanoid biosynthesis、starch and sucrose metabolism通路；Phase I-Phase II和Phase I-Phase III還顯著富集于plant hormone signal transduction代謝通路。并且3個比較中富集于phenylalanine metabolism和phenylpropanoid biosynthesis代謝途徑的基因數(shù)都最多。

2.4 苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑相關基因分析

開始快速吸水期與滯緩吸水期比較中篩選到83個苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑相關基因，滯緩吸水期與重新大量吸水期比較、開始快速吸水期與重新大量吸水期比較分別篩選到110、144個相關差異表達基因。其中3個比較中共有48個苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑相關差異表達基因，PhaseⅠ-PhaseⅡ、PhaseⅡ-PhaseⅢ和PhaseⅠ-PhaseⅢ分別特有6、6和13個差異表達基因。如圖5所示，各個苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝相關差異表達基因在不同吸水時期樣品中的表達量表明，大部分相關基因表達量上調(diào)，只有少量基因表達量下調(diào)，這說明此部分基因在谷子萌發(fā)吸脹啟動中發(fā)揮重要作用，特別是下調(diào)基因可能在種子中有已形成mRNA儲備?；蚣易鍤w類分析表明（圖6），此部分基因中，過氧化物酶（peroxidase，EC:1.11.1.7）占59.2%，β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，EC:3.2.1.21）為14%，其次為4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumarate--CoA ligase，EC:6.2.1.12）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，EC:1.1.1.195）和咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid 3-O-methyltransferase，EC:2.1.1.68）。可見苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑在谷子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用，并通過關鍵基因表達調(diào)控種子萌發(fā)。

2.5 差異表達基因的熒光定量PCR分析

挑選谷子苯丙烷生物合成途徑關鍵基因進行qRT-PCR分析，以整體觀測其在不同萌發(fā)時期的表達模式，驗證轉(zhuǎn)錄物組分析結果，結果表明，在谷子萌發(fā)吸水的17 h過程中（圖7），（Seita.1G065800）呈先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)表達趨勢；（Seita.9G492600）和（Seita.3G004800）呈上調(diào)趨勢；（Seita.5G145500）萌發(fā)后期呈上調(diào)趨勢。這些基因在開始快速吸水期（3 h和5 h）、滯緩吸水期（9 h和11 h）、重新大量吸水期（15 h和17 h）表達趨勢與轉(zhuǎn)錄物組分析結果表達趨勢一致，除Seita.3G004800在15 h略有不同，分析其原因可能由于15 h樣品全部為培養(yǎng)14 h后移苗1 h的樣品，移苗可能對已經(jīng)露白的萌發(fā)種子造成了傷害。再結合代謝圖分析，Seita.1G065800為上游代謝基因，Seita.9G492600、Seita.3G004800和Seita.5G145500為下游代謝基因，說明在谷子萌發(fā)過程中Seita.1G065800發(fā)揮重要作用，并在種子中有所儲備，以利于種子的萌發(fā)。

2.6 苯丙烷類關鍵代謝物含量分析

鑒于苯丙烷生物合成途徑重要性，對其相關重要次生代謝物進行分析（圖8），結果表明，芥子酸在種子中大量儲備，在萌發(fā)0—17 h中呈下調(diào)趨勢；肉桂酸在此階段保持恒定；阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸呈先上調(diào)后下調(diào)趨勢。可見芥子酸和苯丙烷生物合成途徑可能在種子休眠萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。

橫坐標為富集因子（Rich Factor），表示差異表達基因中注釋到某通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值?？v坐標表示通路名稱；圓圈的大小表示通路中富集的基因數(shù)目，圓圈越大，表示基因越多；圓圈的顏色代表q value

圖5 苯丙烷類相關的不同萌發(fā)吸水階段間差異表達基因的表達分析

3 討論

3.1 谷種萌發(fā)相關代謝途徑

植物生長發(fā)育始于種子萌發(fā)。種子萌發(fā)是植物恢復新的生命周期的一個復雜過程，涉及一系列生長代謝和合成途徑，以及分子、生理、生化和形態(tài)上的變化，如隨著水吸入干種子細胞，呼吸強度明顯增高、暫時的膜結構擾動、主要儲存物質(zhì)活化、多聚體的重聚、已形成mRNAs的翻譯、新mRNA的合成、細胞膜和DNA的修復等[35-36]。本研究比較谷子種子不同吸水階段的轉(zhuǎn)錄物組差異，發(fā)現(xiàn)大量表達差異表達基因COG富集于碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、轉(zhuǎn)錄、復制重組和修復、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶等途徑。而GO富集更進一步將其聚焦于萌動種子對周圍環(huán)境條件的感應，如對寒冷、缺水、缺氧、干枯、氧化壓力、karrikin等的反應。并且各個階段各有所側(cè)重，如PhaseⅠ-PhaseⅡ主要涉及對油菜素內(nèi)脂的反應、根毛伸長、甾醇生物合成和水轉(zhuǎn)運4個通路；PhaseⅡ-PhaseⅢ主要集中氮的轉(zhuǎn)運、油菜素類固醇生物合成、真菌防御反應、乙酰輔酶A代謝和細胞板形成引起的細胞分裂通路；PhaseⅠ-PhaseⅢ主要與冷反應、植物型細胞壁松弛、油菜素類固醇生物合成、根毛伸長、DNA復制起始。而KEGG富集將3個比較的差異表達基因顯著富集于苯丙氨酸代謝、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代謝通路。這與許冰霞等[13]分析谷子萌發(fā)期響應干旱脅迫的基因表達譜結果一致，PEG脅迫處理10和18 h的谷子種子差異表達基因參與到苯丙烷生物合成過程。鹽脅迫條件下，培養(yǎng)7 d去掉胚根胚芽的豫谷2和安04的萌發(fā)種子的KEGG富集分析也發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DEGs主要富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導、精氨酸及脯氨酸代謝、淀粉及糖代謝、次生代謝物合成等途徑；下調(diào)DEGs主要富集在氨基酸合成、甘油磷脂代謝、苯丙烷合成等代謝途徑[14]。

圖6 苯丙烷類相關的不同萌發(fā)吸水階段間差異表達基因的功能分類

圖7 苯丙烷類相關基因在不同萌發(fā)吸水時期的qRT-PCR表達分析

圖8 苯丙烷類相關代謝物不同萌發(fā)吸水時期含量變化

3.2 植物苯丙烷生物合成途徑及其基因

苯丙氨酸代謝是苯丙烷生物合成的上游途徑，為苯丙烷類合成提供前體。苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑涉及一系列的基因，縱觀其代謝圖（K00940和K00360）主要基因有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，EC4.3.1.24和EC4.3.1.25)、4-香豆酸-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase，EC6.2.1.12）、肉桂酰-CoA還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，EC1.2.1.44）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，EC1.1.1.195）、過氧化物酶（peroxidase，EC1.11.1.7）等。苯丙氨酸解氨酶（PAL)催化L-苯丙氨酸直接脫氨產(chǎn)生反式肉桂酸，是苯丙烷生物合成途徑的關鍵酶和限速酶，在病原物侵害、傷害、營養(yǎng)缺乏、紫外線輻射、極端溫度等條件下被誘導[16,21,39-45]，并且涉及水楊酸的合成[46-48]。過氧化物酶是一個多基因家族，有非常多家族成員，催化H2O2和各種還原物的氧化還原反應，參與各種復雜生理過程[49-50]，如激素代謝[51]、活性氧和活性氮代謝[52]、植物疾病防御等[51,53-54]。植物所特有的過氧化物酶為ClassⅢ過氧化物酶（POX，EC1.11.1.7)，是苯丙烷生物合成途徑的下游基因，涉及分泌途徑、液泡[55-56]，細胞壁化合物聚合、抵御病原體攻擊、耐鹽性、氧化應激、植物激素和生物堿代謝、棉纖維伸長和枝根發(fā)育等[50-51,57-60]。本研究谷子種子不同吸水階段的差異表達基因功能富集分析結果表明，谷子萌發(fā)與苯丙氨酸代謝和苯丙烷生物合成途徑密切相關，篩選到157個與2個途徑相關的差異表達基因，如過氧化物酶（peroxidase，EC:1.11.1.7）、β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，EC:3.2.1.21）、4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumarate--CoA ligase，EC:6.2.1.12）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，EC:1.1.1.195）、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid 3-O-methyltransferase，EC:2.1.1.68）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL，EC4.3.1.24）和肉桂酰-CoA還原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR，EC1.2.1.44）等。過氧化物酶（EC:1.11.1.7）基因共檢測到157個，其中93個與苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝相關，占全部苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑相關差異表達基因的占59.2%。相似結果出現(xiàn)低溫萌發(fā)蓖麻轉(zhuǎn)錄物組中，Wang等[15]發(fā)現(xiàn)苯丙烷生物合成相關基因、、、、出現(xiàn)顯著下調(diào)。許冰霞等[13]分析PEG干旱脅迫處理10和18 h谷子萌發(fā)種子基因表達譜，獲知PAL可能在PEG脅迫下調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)。顯然苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝相關基因在谷子萌發(fā)吸水過程中被精密調(diào)控，特別是POX家族成員可能在谷子萌發(fā)木質(zhì)素合成、細胞壁的形成、根系伸長過程中發(fā)揮重要作用。

3.3 植物苯丙烷類相關代謝物

植物中苯丙烷生物合成途徑的形成是植物防御非生物和生物脅迫的長期進化結果[37]。苯丙烷生物合成途徑可催化苯丙氨酸形成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸等多種酚類化合物。目前已知苯丙烷及其相關代謝物，如肉桂酸、阿魏酸、芥子酸等，是抑制種子萌發(fā)的重要的他感物質(zhì)[38]。為此本研究分析了不同吸水階段谷子萌發(fā)種子中幾種他感物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)在未萌發(fā)種子中含有大量芥子酸，在萌發(fā)過程中呈下調(diào)趨勢，阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸呈先上調(diào)后下調(diào)趨勢，肉桂酸保持恒定，暗示芥子酸和苯丙烷生物合成途徑可能在種子萌發(fā)啟動過程中發(fā)揮重要作用。

4 結論

谷子萌發(fā)開始快速吸水階段、滯緩吸水階段、重新大量吸水階段的苯丙烷生物合成和苯丙氨酸代謝途徑及其中間產(chǎn)物、基因在谷子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，特別是芥子酸可能參與調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，在未萌動種子中大量儲備，萌發(fā)吸水過程中顯著下調(diào)；上游基因4-香豆酰-輔酶A連接酶在未萌發(fā)種子中存在已形成mRNA，在萌發(fā)吸水階段呈先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)表達趨勢；下游基因過氧化物酶家族成員也參與谷子萌發(fā)過程。

[1] BEWLEY J D, BLACK M.. New York: Plenum Press, 1994.

[2] 畢辛華, 戴心維. 種子學. 北京:農(nóng)業(yè)出版社, 1993.

BI X H, DAI X W.. Beijing: Agricultural Press, 1993. (in Chinese)

[3] BEWLEY J D. Seed germination and dormancy., 1997, 9: 1055-1066.

[4] 張錦鵬, 王茅雁, 白云鳳, 賈晉平, 王國英. 谷子品種抗旱性的苗期快速鑒定. 植物遺傳資源學報, 2005(1): 59-62.

ZHANG J P, WANG M Y, BAI Y F, JIA J P, WANG G Y. Rapid evaluation on drought tolerance of foxtail millet at seedling stage., 2005(1): 59-62. (in Chinese)

[5] 朱學海. 谷子耐旱資源篩選及其遺傳多樣性分析[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2008.

ZHU X H. Selecting drought resources and its analysis of genetic diversity in foxtail millet[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008. (in Chinese)

[6] 秦嶺, 楊延兵, 管延安, 張華文, 王海蓮, 劉賓, 陳二影. 不同生態(tài)區(qū)主要育成谷子品種芽期耐旱性鑒定. 植物遺傳資源學報, 2013, 14(1): 146-151.

QIN L, YANG Y B, GUAN Y A, ZHANG H W, WANG H L, LIU B, CHEN E Y. Identification of drought tolerance at germination period of foxtail millet cultivars developed from different ecological regions., 2013, 14(1): 146-151. (in Chinese)

[7] BHEEMESH S J, SUBBA RAO M, REDDI SEKHAR M, LATHA P. Effect of PEG-induced drought stress on germination early seedling growth of foxtail millet varieties., 2018, special issue-6: 2674-2681.

[8] 王春梅, 閆雙堆, 卜玉山, 劉利軍, 張乃于. As對谷子萌發(fā)、幼苗生長及抗氧化酶系統(tǒng)的影響. 水土保持學報, 2018, 32(6):354-360.

WANG C M, YAN S D, BU Y S, LIU L J, ZHANG N Y. Effect of As stress on millet germination, seedling growth and antioxidant system., 2018, 32(6): 354-360. (in Chinese)

[9] 裴帥帥, 尹美強, 溫銀元, 黃明鏡, 張彬, 郭平毅, 王玉國, 原向陽. 不同品種谷子種子萌發(fā)期對干旱脅迫的生理響應及其抗旱性評價. 核農(nóng)學報, 2014, 28(10): 1897-1904.

PEI S S, YIN M Q, WEN Y Y, HUANG M J, ZHANG B, GUO P Y, WANG Y G, YUAN X Y. Physiological response of foxtail millet to drought stress during seed germination and drought resistance evaluation., 2014, 28(10): 1897-1904. (in Chinese)

[10] 楊凈, 王宏富, 魚冰星, 李智, 王鈺云. 超重力對谷子種子萌發(fā)及生理生化特性的影響. 激光生物學報, 2018, 27(4): 83-88.

YANG J, WANG H F, YU B X, LI Z, WANG Y Y. Effects of hypergravity on seed germination and physiological and biochemical characteristics of foxtail millet., 2018, 27(4): 83-88. (in Chinese)

[11] TANG S, LI L, WANG Y, CHEN Q, ZHANG W, JIA G, ZHI H, ZHAO B, DIAO X. Genotype-specific physiological and transcriptomic responses to drought stress in(an emerging model for Panicoideae grasses)., 2017, 7(1): 10009.

[12] 竇祎凝, 秦玉海, 閔東紅, 張小紅, 王二輝, 刁現(xiàn)民, 賈冠清, 徐兆師, 李連城, 馬有志, 陳明. 谷子轉(zhuǎn)錄因子SiNAC18通過ABA信號途徑正向調(diào)控干旱條件下的種子萌發(fā). 中國農(nóng)業(yè)科學, 2017, 50(16): 3071-3081.

DOU Y N, QIN Y H, MIN D H, ZHANG X H, WANG E H, DIAO X M, JIA G Q, XU Z S, LI L C, MA Y Z, CHEN M. Transcription factor SiNAC18 positively regulates seed germination under drought stress through ABA signaling pathway in foxtail millet (L.)., 2017, 50(16): 3071-3081. (in Chinese)

[13] 許冰霞, 尹美強, 溫銀元, 裴帥帥, 柯貞進, 張彬, 原向陽. 谷子萌發(fā)期響應干旱脅迫的基因表達譜分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2018, 51(8): 1431-1447.

XU B X, YIN M Q, WEN Y Y, PEI S S, KE Z J, ZHANG B, YUAN X Y. Gene expression profiling of foxtail millet (L.) under drought stress during germination., 2018, 51(8): 1431-1447. (in Chinese)

[14] 潘教文, 李臻, 王慶國, 管延安, 李小波, 戴紹軍, 丁國華, 劉煒. NaCl處理谷子萌發(fā)期種子的轉(zhuǎn)錄組學分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2019, 52(22): 3964-3975.

PAN JW, LI Z, WANG QG, GUAN YA, LI XB, DAI SJ, DING GH, LIU W. Transcriptomics analysis of NaCl response in foxtail millet (L.) seeds at germination stage., 2019, 52(22): 3964-3975. (in Chinese)

[15] WANG X, WANG L J, YAN X C, WANG L, TAN M L, GENG X X, WEI W H. Transcriptome analysis of the germinated seeds identifies low-temperature responsive genes involved in germination process in.2016, 38(1): 6.

[16] DIXON R A. Stress-induced phenylpropanoid metabolism., 1995, 7: 1085-1097.

[17] LA CAMERA S, GOUZERH G, DHONDT S, HOFFMANN L, FRITIG B, LEGRAND M, HEITZ T. Metabolic reprogramming in plant innate immunity: the contributions of phenylpropanoid and oxylipin pathways., 2004, 198: 267-284.

[18] VOGT T. Phenylpropanoid biosynthesis., 2010, 3: 2-20.

[19] LIU X Y, WANG P P, WU Y F, CHENG A X, LOU H X. Cloning and functional characterization of two 4-coumarate: CoA ligase genes from., 2018, 23: 595.

[20] HAHLBROCK K, SCHEEL D. Physiology and molecular biology of phenylpropanoid metabolism., 1989, 40: 347-369.

[21] KIM D S, HWANG B K. An important role of the pepper phenylalanine ammonia-lyase gene (1) in salicylic acid-dependent signalling of the defence response to microbial pathogens., 2014, 65(9): 2295-2306.

[22] KIM D, PERTEA G, TRAPNELL C, PIMENTEL H, KELLEY R, SALZBERG S L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions., 2013, 14: R36.

[23] FLOREA L, SONG L, SALZBERG S L. Thousands of exon skipping events differentiate among splicing patterns in sixteen human tissues., 2013, 2: 188.

[24] SCHULZE S K, KANWAR R, G?LZENLEUCHTER M, THERNEAU T M, BEUTLER A S. SERE: Single-parameter quality control and sample comparison for RNA-Seq., 2012, 13(1): 524.

[25] ANDERS S, HUBER W. Differential expression analysis for sequence count data., 2010, 11(10): R106.

[26] 鄧泱泱, 荔建琦, 吳松鋒, 朱云平, 陳耀文, 賀福初. nr數(shù)據(jù)庫分析及其本地化. 計算機工程, 2006, 32(5): 71-74.

DENG Y Y, LI J Q, WU S F, ZHU Y P, CHEN Y W, HE F C. Integrated nr database in protein annotation system and its localization., 2006, 32(5): 71-74. (in Chinese)

[27] APWEILER R, BAIROCH A, WU C H, BARKER W C, YEH L S L. Uniprot: the universal protein knowledgebase., 2004, 32(D1): D115-D119.

[28] KANEHISA M, GOTO S, KAWASHIMA S, OKUNO Y, HATTORI M. The KEGG resource for deciphering the genome., 2004(32): D277-D280.

[29] TATUS R L, GALPERIN M Y, NATALE D A, KOONIN E V. The COG database: A tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution., 2000, 28(1): 33-36.

[30] ASHBURNER M, BALL C A, BLAKE J A, BOTSTEIN D, BUTLER H, CHERRY J M, DAVIS A P, DOLINSKI K, DWIGHT S S, EPPIG J T, HARRIS M A, HILL D P, ISSEL-TARVER L, KASARSKIS A, LEWIS S, MATESE J C, RICHARDSON J E, RINGWALD M, RUBIN G M, SHERLOCK G. Gene ontology: Tool for the unification of biology., 2000, 25(1): 25-29.

[31] ALEXA A, RAHNENFUHRER J. topGO: Enrichment analysis for gene ontology. R package version 2.8, 2010.

[32] SUPEK F, BO?NJAK M, ?KUNCA N, ?MUC T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of Gene Ontology terms., 2011, 6: e21800

[33] PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR., 2001, 29: 900.

[34] MOLNáR-PERL I, FüZFAI Z. Chromatographic, capillary electrophoretic and capillary electrochromatographic techniques in the analysis of flavonoids., 2005, 1073: 201-227.

[35] CATUSSE J, JOB C, JOB D. Transcriptome- and proteome-wide analyses of seed germination., 2008, 331: 815-822.

[36] RAJJOU L, DUVAL M, GALLARDO K, CATUSSE J, BALLY J, JOB C, JOB D. Seed germination and vigor., 2012, 63: 507-533.

[37] FERRER J L, AUSTIN M B, STEWART C J R, NOEL J P. Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids., 2008, 46: 356-370.

[38] REIGOSA M J, MALVIDO-PAZOS E. Phytotoxic effects of 21 plant secondary metabolites ongermination and root growth., 2007, 33: 1456-1466.

[39] EDWARDS K, CRAMER C L, BOLWELL G P, DIXON R A, SCHUCH W, LAMB C J. Rapid transient induction of phenylalanine ammonia-lyase mRNA in elicitor-treated bean cells., 1985, 82: 6731-6735.

[40] LIANG X W, DRON M, CRAMER C L, DIXON R A, LAMB C J. Differential regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes during plant development and by environmental cues., 1989, 264: 14486-14492.

[41] LIANG X W, DRON M, SCHMID J, DIXON R A, LAMB C J. Developmental and environmental regulation of a phenyl- alanine ammonia-lyase-β-glucuronidase gene fusion in transgenic tobacco plants., 1989, 86: 9284-9288.

[42] HUANG J, GU M, LAI Z, FAN B, SHI K, ZHOU Y H, YU J Q, CHEN Z. Functional analysis of thePAL gene family in plant growth, development, and response to environmental stress., 2010, 153: 1526-1538.

[43] PAYYAVULA R S, NAVARRE D A, KUHL J C, PANTOJA A, PILLAI S S. Differential effects of environment on potato phenylpropanoid and carotenoid expression., 2012, 12: 39.

[44] JIN Q, YAO Y, CAI Y, LIN Y. Molecular cloning and sequence analysis of a phenylalanine ammonia-lyase gene from Dendrobium., 2013, 8: e62352.

[45] MACDONALD M J, D’CUNHA G B. A modern view of phenylalanine ammonia lyase., 2007, 85: 273-282.

[46] MAUCH-MANI B, SLUSARENKO A J. Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine mmonia-lyase in the resistance ofto., 1996, 8: 203-212.

[47] NUGROHO L H, VERBERNE M C, VERPOORTE R. Activities of enzymes involved in the phenylpropanoid pathway in constitutively salicylic acid-producing tobacco plants., 2002, 40: 775-760.

[48] CHAMAN M E, COPAJA S V, ARGANDONA V H. Relationships between salicylic acid content, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity, and resistance of barley to aphid infestation., 2003, 51: 2227-2231.

[49] PASSARDI F, LONGET D, PENEL C, AND DUNAND C. The class III peroxidase multigenic in land plants family in rice and its evolution., 2004, 65: 1879-1893.

[50] PASSARDI F, COSIO C, PENEL C, AND DUNAND C. Peroxidases have more functions than a Swiss army knife., 2005, 24: 255-265.

[51] HIRAGA S, SASAKI K, ITO H, OHASHI Y, MATSUI H. A large family of class Ⅲ plant peroxidases., 2001, 42(5): 462-468.

[52] ALMAGRO L, GóMEZ ROS L V, BELCHI-NAVARRO S, BRU R, ROS BARCELó A, PEDRE?O M A. Class III peroxidases in plant defence reactions., 2009, 60(2): 377-390.

[53] HILAIRE E, YOUNG S A, WILLARD L H, MCGEE J D, SWEAT T, CHITTOOR J M, GUIKEMA J A, LEACH J E. Vascular defense responses in rice: peroxidase accumulation in xylem parenchyma cells and xylem wall thickening., 2001, 14(12): 1411-1419.

[54] COEGO A, RAMIREZ V, ELLUL P, MAYDA E, VERA P. The H2O2-regulated Ep5C gene encodes a peroxidase required for bacterial speck susceptibility in tomato., 2005, 42(2): 283-293.

[55] WELINDER K G. Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases., 1992, 2: 388-393.

[56] WELINDER K G, JUSTESEN A F, KJ?RSG?RD I V H, JENSEN R B, RASMUSSEN S K, JEPERSEN H M, DUROUX L. Structural diversity and transcription of class III peroxidases from.2002, 269: 6063-6081.

[57] GABALDóN C, LóPEZ-SERRANO M, PEDRE?O M A, ROS BARCELó A. Cloning and molecular characterization of the basic peroxidase isoenzyme from Zinnia elegans, an enzyme involves in lignin biosynthesis., 2005, 139: 1138-1154.

[58] PASSARDI F, TOGNOLLI M, DE MEYER M, PENEL C, DUNAND C. Two cell wall associated peroxidases frominfluence root elongation., 2006, 223: 965-974.

[59] COSTA, M M, HILLIOU F, DUARTE P, PEREIRA L G, ALMEIDA I, LEECH M, MEMELINK J, BARCELó A R, SOTTOMAYOR M. Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in., 2008, 146: 403-417.

[60] MEI W, QIN Y, SONG W, LI J, ZHU Y. Cotton GhPOX1 encoding plant class III peroxidase may be responsible for the high level of reactive oxygen species production that is related to cotton fiber elongation., 2009, 36: 141-150.

Screening and analysis of key metabolic pathways in foxtail millet during different water uptake phases of germination

YU AiLi, ZHAO JinFeng, CHENG Kai, WANG ZhenHua, ZHANG Peng, LIUXin, TIAN Gang, Zhao TaiCun, WANG YuWen

(Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Changzhi 046011, Shanxi)

【】 Foxtail millet (L.) is a hardy cereal and known for its tolerance against drought and barrenness, which originated in China. In this study, the transcriptome of foxtail millet was analyzed in germinating seeds during different uptake of water phases, which is to get a lot of differently expressed genes, and find the important metabolic pathways, key genes and metabolites of regulating germination in foxtail millet. 【】The cDNA libraries of Jingu 20 were constructed in germinating seeds during rapid initial uptake of water, plateau phase, further increase in water uptake for the transcriptome analysis. The cluster analysis of gene expression was performed by K-Means. Differential expression analysis used DESeq. The functional annotations of differentially expressed genes were obtained by using COG, GO, KEGG, and so on. The key metabolism pathways and genes that regulated germination in foxtail millet were found during different water uptake phase through KEGG enrichment of DEGs. The reliability of sequencing results was confirmed by qRT-PCR. The contents of metabolites were assayed by HPLC.【】The genome-wide gene expression profile was obtained by RNA-sequencing during rapid initial uptake of water, plateau phase and further increase in water uptake. A total of 33 643 genes were expressed. Nine co-expression clusters with distinctive patterns were identified. There were 3 893, 4 612 and 8 472 DEGs in rapid initial uptake of water and plateau phase, plateau phase and further increase in water uptake, rapid initial uptake of water and further increase in water uptake, respectively. The KEGG pathway enrichment analysis showed that these DEGs of the three comparisons were significantly associated with phenylpropanoid biosynthesis，phenylalanine metabolism, starch and sucrose metabolism. The DEGs between rapid initial uptake of water and plateau phase, between rapid initial uptake of water and further increase in water uptake were also enriched in plant hormone signal transduction. And the number of genes enriched in the metabolism pathway of phenylpropanoid biosynthesis and phenylalanine metabolism was the largest in the three comparisons. The peroxidase genes had the highest proportion among these genes of the two pathways. The results obtained from four phenylpropanoids-related genes tested by qRT-PCR were consistent with the trend of regulation identified by gene expression profile. In dormant seeds of foxtail millet, there was the preformed mRNAs of 4-coumarate-CoA ligase 3, which displayed firstly decreasing, then increasing and finally declining patterns during the uptake of water stage. The contents of phenylpropanoids-related metabolites in germination seeds of foxtail millet indicated that large amounts of sinapic acid were stored in dormant seeds. During uptake of water by a dry seed, the content of sinapic acid gradually decreased, but those of p-coumaric acid, caffeic acid and ferulic acid increased first and then decreased. 【】DEGs of foxtail millet were significantly related with phenylpropanoid biosynthesis and phenylalanine metabolism in germinating seeds during different uptake of water stages. The upstream and downstream genes of phenylpropanoid biosynthesis, such as 4-coumarate-CoA ligase 3 and peroxidase, played regulation roles in response to water during germination of foxtail millet. Sinapic acid participated in the dormancy and germination of millet seeds, which were the medium product of phenylpropanoid biosynthesis pathway.

foxtail millet; water uptake phase of seed germination; transcriptome analysis; phenylpropanoid biosynthesis; phenylalanine metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.002

2019-07-17；

2020-02-02

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-06-13.5-A23）、山西省農(nóng)業(yè)科學院科研項目（YGG17021和YCX2018206）

余愛麗，E-mail：yuailimail@163.com。趙晉鋒，E-mail：zhaojfmail@126.com。余愛麗和趙晉鋒為同等貢獻作者。通信作者王玉文，E-mail：gzswyw@163.com

（責任編輯 李莉）