張道偉，康奎，余亞婭，匡富萍，潘碧瑩，陳靜，唐斌,

白背飛虱酚氧化酶原基因特性及其免疫應(yīng)答

張道偉1，康奎1，余亞婭2，匡富萍1，潘碧瑩3，陳靜2，唐斌1,3

（1遵義師范學院生物與農(nóng)業(yè)科技學院/赤水河流域動物資源保護與應(yīng)用研究特色重點實驗室，貴州遵義 563006；2遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 貴州遵義 563006；3杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 310036）

【】酚氧化酶（phenoloxidase，PO）是昆蟲體內(nèi)的免疫蛋白，在昆蟲體內(nèi)起重要的調(diào)節(jié)作用，主要以無活性的酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）形式存在。本研究在轉(zhuǎn)錄組測序獲得白背飛虱（）3條序列的基礎(chǔ)上，通過分析白背飛虱體內(nèi)不同的發(fā)育和組織表達模式，并進一步抑制的表達以及病原菌誘導，探討在白背飛虱體內(nèi)的生物學功能。【】以白背飛虱3條序列為研究對象，利用生物信息學方法分析其蛋白結(jié)構(gòu)以及與其他昆蟲之間的同源性。并以注射綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的dsRNA作為對照組，通過注射合成的ds后采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因表達抑制效果；此外，為了探究在白背飛虱生長發(fā)育和免疫應(yīng)答方面的作用，利用qRT-PCR檢測在不同發(fā)育階段及組織中的表達情況，以及注射大腸桿菌（）和枯草芽孢桿菌（）后3個的誘導表達情況?！尽?、、的開放閱讀框長度分別為2 079、999、2 070 bp，分別編碼692、332、689個氨基酸，預測蛋白分子量分別為79.84、37.67、79.53 kD，等電點分別為6.43、9.56、6.20。生物信息學分析表明，白背飛虱的3個PPO蛋白具有較高的同源性，且與褐飛虱（）的親緣關(guān)系最近；、、均在成蟲第3天表達量最高，其中和的發(fā)育表達模式相似；和在表皮和脂肪體內(nèi)表達量較高，而在翅和脂肪體內(nèi)表達量較高，在頭、足、中腸、馬氏管中表達量相對較低；與注射ds組相比，注射靶標基因的dsRNA后都能夠顯著沉默目的基因的表達，而且當表達被沉默后，出現(xiàn)顯著高表達，說明不同的之間可能具有補償功能；大腸桿菌誘導后12 h，和表達量顯著升高，表達量則在誘導24 h后顯著升高；枯草芽胞桿菌誘導24 h后，、和表達量均顯著升高。【】、、的表達存在組織和齡期特異性，且在不同菌誘導情況下存在免疫應(yīng)答差異性。研究結(jié)果有助于更加全面、深入地探索白背飛虱酚氧化酶在調(diào)控昆蟲發(fā)育及免疫中的潛在分子機理。

白背飛虱；酚氧化酶原；RNA干擾；實時熒光定量PCR；誘導表達；免疫應(yīng)答

0 引言

【研究意義】水稻（）是我國主要的糧食作物，其穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對國家的穩(wěn)定發(fā)展有著重大的保障作用，但水稻也是被害蟲危害最為嚴重的糧食作物之一，根據(jù)蟲害的發(fā)生面積及其對產(chǎn)量造成的損失，稻飛虱已成為水稻的頭號害蟲[1]。其中，白背飛虱（）是一種水稻生長至中前期時的重要遷飛型害蟲，其若蟲和成蟲均可直接通過刺吸式口器吸食水稻韌皮部汁液，導致水稻植株黃化甚至枯死[1]。酚氧化酶（phenoloxidase，PO）又稱為酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）或酪氨酸酶（tyrosinase），是一種含銅離子結(jié)合位點的氧化酶[2]，是廣泛存在于生物界中的一類含銅蛋白質(zhì)，也是黑色素合成及表皮硬化過程的關(guān)鍵酶，在生物的生命過程中起到重要作用。探究白背飛虱酚氧化酶基因的特性和功能，可為白背飛虱防治提供新思路?！厩叭搜芯窟M展】眾所周知，昆蟲的免疫系統(tǒng)比較簡單，缺乏獲得性免疫[3]，其內(nèi)源免疫系統(tǒng)主要由細胞免疫和體液免疫組成[4]。昆蟲酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）是一種重要的內(nèi)源免疫蛋白[5-7]，PPO激活是昆蟲的初始病原診斷之后發(fā)生的一個級聯(lián)反應(yīng)，包括模式識別蛋白、絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑也參與其中[6-7]，PPO被激活后會在入侵物的周圍產(chǎn)生黑化作用，同時誘導昆蟲產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫[8]。而且PO催化的黑化作用是昆蟲隔絕入侵病原物和修復創(chuàng)傷的核心[5,7,9-10]。昆蟲酚氧化酶原激活系統(tǒng)（prophenoloxidase activating system，proPO-AS），即PPO被激活后誘導昆蟲產(chǎn)生的一系列免疫反應(yīng)，是昆蟲最重要的體液免疫系統(tǒng)之一[11]，為昆蟲免疫系統(tǒng)的重要組成部分[12]。【本研究切入點】PPO參與細胞免疫中的吞噬、成瘤、包囊過程；黑化作用、傷口的愈合；蛻皮后氧化作用促使表皮硬化，參與幾丁質(zhì)代謝途徑等。此外，PO的活性抑制、基因丟失或表達降低均會導致宿主對大多數(shù)病原物抵抗力下降，致使昆蟲免疫力降低，發(fā)育受阻，不能完成蛻皮，從而導致死亡。目前在褐飛虱（）和德國小蠊（）中已分別發(fā)現(xiàn)了2個和1個PPO家族基因[13-14]，研究結(jié)果均表明對病原菌產(chǎn)生了免疫應(yīng)答反應(yīng)。而在白背飛虱中也發(fā)現(xiàn)了3個（），這3個的免疫響應(yīng)機制及其生物學特性還不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究的特性以及在受到入侵后的免疫保護功能，為篩選調(diào)控免疫力等過程的重要靶標基因提供理論依據(jù)，從而為開發(fā)綠色農(nóng)藥打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在遵義師范學院和杭州師范大學完成。

1.1 試驗昆蟲及發(fā)育和組織表達材料的收集

試驗所采用的白背飛虱來自杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院動物學課題組飼養(yǎng)的種群，使用感蟲水稻Taichung Native 1（TN1）飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，光周期16L﹕8D，相對濕度為（70±5）%。待TN1水稻上的白背飛虱若蟲長到4齡后，用于后期發(fā)育表達模式研究的取材以及病原菌誘導試驗；長至5齡的若蟲用于后期RNA干擾（RNA interference，RNAi）的顯微注射試驗。

白背飛虱的發(fā)育表達材料取自從4齡初若蟲至發(fā)育為成蟲后3 d的蟲體，每24 h取材，每個發(fā)育階段取3個平行樣（每個平行樣取10頭白背飛虱）。白背飛虱組織表達材料取自成蟲階段，在萊卡EZ4解剖鏡下解剖獲得白背飛虱的頭、足、翅、中腸、脂肪體、表皮及馬氏管7種材料，每種材料取3個平行樣（每個平行樣取自200頭以上白背飛虱的蟲體），于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的抽提及cDNA的合成

試驗材料的總RNA抽提采用Trizol法，抽提過程中使用的EP管等均需為RNase-free。首先用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，然后用NanoDrop 2000分光光度計測定提取得到的總RNA的濃度及純度。最后根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒的操作說明合成cDNA，合成后保存于-20℃冰箱。

1.3 dsRNA的合成

用Premier 5軟件設(shè)計3個合適的dsRNA特異性引物片段，特異性引物由上海Invitrogen公司合成。然后使用合成的特異性引物進行PCR擴增，產(chǎn)物進行T克隆，具體引物序列見表1。再使用帶T7啟動子的引物進行交叉PCR反應(yīng)，對照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒的操作說明合成3個的dsRNA。通過NanoDropTM2000測定合成的dsRNA的濃度及純度，同時對照組的dsRNA也采用同樣的方法合成[15]。

1.4 誘導源的制備

選擇大腸桿菌（）（革蘭氏陰性菌）和枯草芽孢桿菌（）（革蘭氏陽性菌）作為誘導源。在無菌條件下，分別取實驗室保存的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上進行平板劃線，37℃過夜培養(yǎng)；然后挑取單菌落接種到10 ml LB液體培養(yǎng)基（無抗），37℃，200 r/min過夜培養(yǎng)至大腸桿菌的OD600約為0.6，枯草芽孢桿菌OD600約為0.75。培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至離心管，5 000 r/min離心10 min以富集菌體，棄上清后加入磷酸緩沖液PBS（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，400 mmol·L-1NaCl），在12 000 r/min下離心1 min。洗滌2次后加入PBS，滅活。最后，用PBS在12 000 r/min下離心1 min洗滌菌體兩次，向細胞沉淀中加入1 ml的PBS即制成濃度約為5×107cells/mL的誘導源。

表1 實時熒光定量PCR引物和PPO、GFP的dsRNA引物序列

T7 sequence: GGATCCTAATACGACTCACTATAGG

1.5 白背飛虱的顯微注射

RNA干擾：通過顯微注射系統(tǒng)注射到白背飛虱體內(nèi)的材料分別為ds和ds。挑取5齡第1天的白背飛虱備用，首先開啟顯微注射系統(tǒng)，然后通過調(diào)節(jié)氮氣壓力并在顯微鏡下用標準毛細管測量來確定每次注射的dsRNA的體積，注射量為50 ng/頭。再用CO2將5齡初期的白背飛虱麻痹10—15 s，然后將其腹部朝上整齊地固定于瓊脂糖凝膠擺放板的凹槽中，顯微注射的部位為白背飛虱第二和第三對足間的腹基節(jié)連接處。注射后將白背飛虱重新放回含水稻的玻璃管中，玻璃管管口用棉塞塞住并放入人工氣候室。注射24 h后白背飛虱的存活數(shù)為有效注射數(shù)。注射后48 h和72 h分別取材，每個時間點取3個平行樣，每個平行樣10頭白背飛虱，用于qRT-PCR分析的表達情況。

病原菌的誘導：白背飛虱的麻醉及擺放方法同上，然后用微量注射系統(tǒng)將誘導源或PBS緩沖液（每頭若蟲注射量為0.1 μL）注射到白背飛虱體內(nèi)。注射后白背飛虱的飼養(yǎng)方法同上。收集注射后12、24、36、48、72 h的樣品，每個時間點3個平行樣，每個平行樣5頭，所有的樣品于-80℃保存?zhèn)溆茫糜诜治霭妆筹w虱的誘導表達情況。

1.6 SfPPO表達的測定

將白背飛虱顯微注射后48 h和72 h的材料以及病原菌誘導后的材料抽提總RNA后反轉(zhuǎn)錄，得到3管平行的cDNA用于qRT-PCR的檢測。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μl）：10 μL SYBR Premix Ex Taq；1 μl上游/下游引物；1 μl cDNA；7 μl滅菌水。選用白背飛虱18S基因作為內(nèi)參基因[16]，具體引物序列見表1。qRT-PCR程序：95℃預變性10 s，95℃解鏈5 s，59℃退火并延伸30 s，39個循環(huán)。每個處理3個模板，每個模板重復3次。檢測基因的相對拷貝數(shù)用2-ΔΔCT方法進行分析[17]：2-ΔΔCT=2-[(CT待測組-CT待測組18S)- (CT對照組-CT對照組18S)]。

1.7 SfPPO及蛋白序列的分析

使用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的BLAST-N和BLAST-X工具，將的cDNA序列與GenBank中存在的其他基因序列進行比較。使用多序列比對網(wǎng)站（http://bioinfo.genotoul.fr/ multalin/multalin.html）上提供的工具和DNAMAN軟件對ds的cDNA片段進行多序列比對。選取已知的SfPPO蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進行自舉分析，并使用1 000次重復驗證每個群集的穩(wěn)健性。使用ExPASy蛋白質(zhì)組預測工具網(wǎng)站（http://expasy.org/ tools/dna.html）上的翻譯工具，從相應(yīng)的cDNA序列推導出本研究中使用的SfPPO蛋白序列和其他分析標準，包括MW、pI等。SfPPO蛋白的糖基化位點以及跨膜結(jié)構(gòu)分別通過Dicty OGlyc在線軟件（http://www. cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）和TMHMM Server在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）進行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，然后通過SigmaPlot 10.0和SPSS軟件對整理后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，最后采用One-Way ANOVA法和Turkey檢驗進行差異顯著性檢驗（＜0.05為差異顯著，用*表示；＜0.01為差異極顯著，用**表示），并利用單因素方差分析Student Newmane Keuls（S-N-K）測試，比較3組試驗的平均值在5%水平上是否有差異顯著性（不同字母表示數(shù)值之間存在顯著性差異，即＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 SfPPO及蛋白序列分析

對于獲得的白背飛虱的3條序列進行分析，發(fā)現(xiàn)白背飛虱的3條（、和）的開放閱讀框長度分別為2 079、999、2 070 bp，分別編碼692、332、689個氨基酸，預測蛋白分子量分別為79.84、37.67、79.53 kD，等電點分別為6.43、9.56、6.20。通過SfPPO蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域TMHMM分析，推測這3個SfPPO蛋白不含跨膜區(qū)域，可能是SfPPO在核糖體合成后，經(jīng)過翻譯加工成為成熟蛋白質(zhì)，可通過細胞破裂釋放進入細胞液中。DictyOGlyc預測結(jié)果表明SfPPO1和SfPPO2-2只含1個糖基化位點，而SfPPO2-1不含糖基化位點（圖1）。

2.2 SfPPO蛋白的系統(tǒng)進化分析

選擇岡比亞按蚊（）、南瓜緣蝽（）、致倦庫蚊（）、柑橘粉虱（）、紅褐斑腿蝗（）、中華豆芫菁（）、西花薊馬（）、西伯利亞蝗（）、飛蝗（）、褐飛虱、條蜂緣蝽（）、麻蠅（）、赤擬谷盜（）、黃粉蟲（）、瓜實蠅（）和南亞果實蠅（）的PPO蛋白序列與SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2蛋白進行進化分析，結(jié)果顯示SfPPO1與褐飛虱PPO1（NlPPO1）聚在一支，SfPPO2-1與NlPPO2聚在一支，而SfPPO2-2獨為一支（圖2），表明白背飛虱與褐飛虱的親緣關(guān)系較近。

2.3 SfPPO不同發(fā)育階段表達分析

不同發(fā)育表達模式不同，在成蟲第3天表達量最高，5齡第2天表達量最低（圖3-A）；和發(fā)育表達模式一致，分別在成蟲第3天時表達量最高，成蟲第1天時表達量最低（圖3-B、3-C）。

N4D1—N4D3：4齡第1—3天1st-3rd day of 4th stage；N5D1—N5D3：5齡第1—3天1st-3rd day of 5th stage；AD1—AD3：成蟲期第1—3天1st-3rd day of adult stage

2.4 SfPPO的組織表達分析

和均在脂肪體和表皮中表達量最高（圖4-A、4-B），在翅和脂肪體中表達量較高（圖4-C），而在其余各個組織中，的表達量均相對較低。

2.5 白背飛虱RNA干擾后各SfPPO的表達

在合成dsRNA前為了確認用于ds合成的cDNA片段的特異性，首先對3個ds的cDNA片段進行比對，從比對結(jié)果可以看到，每兩個ds的cDNA片段之間連續(xù)相同的堿基最多均不超過14 bp（圖5-A），各ds片段均比較特異。通過注射這些ds抑制各的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個的本基因dsRNA注射后，在48 h和72 h均顯著或極顯著下降（圖5-B、5-C、5-D），表明、和的RNAi試驗是成功的。此外，表達在ds注射后顯著上升（圖5-B）；而和的dsRNA注射后，均極顯著低表達（圖5-C）；的表達在注射各ds后，除注射ds后48 h外，其他均顯著下降（圖5-D）。

2.6 菌誘導后SfPPO的響應(yīng)情況

通過病原菌誘導發(fā)現(xiàn)、和在注射革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌24 h后其表達量均顯著提高，而后下降并恢復到正常水平（圖6）。注射革蘭氏陰性菌大腸桿菌12 h后和的表達量均顯著提高（圖6-B、6-C），而的表達則在注射24 h后顯著上升（圖6-A）。暗示、和在對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的免疫應(yīng)答方面存在差異。

3 討論

昆蟲酚氧化酶原（PPO）參與細胞以及體液免疫反應(yīng)，是一種具有重要功能的內(nèi)源免疫蛋白。PPO被激活后誘導昆蟲產(chǎn)生的酚氧化酶原級聯(lián)（prophenoloxidase cascade）反應(yīng)為昆蟲防御系統(tǒng)提供非己識別分子，又為清除非己提供重要效應(yīng)分子，作為一種識別和防御系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用，是昆蟲免疫系統(tǒng)重要的組成部分[12]。PPO是一個多基因家族，每個成員之間功能存在差異。果蠅和家蠶（）分別有3個和2個，而通過搜索蚊類的基因組發(fā)現(xiàn)其有10個以上的。本研究通過生物信息學方法搜索比對白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，得到3條的cDNA序列，表明在白背飛虱中SfPPO也是一個多基因家族，至少存在3個及以上PPO成員。LU等[18]通過對已登錄到GenBank的昆蟲PPO進行進化分析，發(fā)現(xiàn)其可以被聚為3個大類，然而其起源時間未知，而本研究中3個也被聚為3個大類，與前述結(jié)果一致。根據(jù)進化分析結(jié)果，PPO在不同昆蟲之間是高度保守的，并且在進化過程中也是高度保守的（圖2）。

圖4 SfPPO在白背飛虱不同組織中的表達情況

研究表明，PPO主要存在于昆蟲的血清、血細胞、中腸及表皮等組織中[19]，如蟑螂的PPO主要存在于血細胞中；家蠶、煙草天蛾（）的PPO則主要存在于血清中[20]；而在棉鈴蟲（）的血清和血細胞中均能檢測到PPO的活性[21]。馮從經(jīng)等[22]將亞州玉米螟（）血清純化后也得到了該酶。家蠶、野桑蠶（）幼蟲的PPO活性具有明顯的發(fā)育和組織特異性[23]。本研究結(jié)果與上述研究一致，不同發(fā)育表達和組織表達均不同（圖3、圖4）。盡管本試驗未能檢測白背飛虱血淋巴中各的表達情況，但供檢測的頭、足、翅、中腸、脂肪體、表皮和馬氏管均有表達（圖4）。家蠶的主要在血淋巴中表達，而在家蠶的每個組織均有表達，暗示其功能存在不同。野桑蠶中和的組織表達研究結(jié)果與家蠶類似[23]。然而，在表皮中表達量較低，而在翅中表達量較高，表明可能在翅中具有更為重要的功能。

RNA干擾作為一種有效的基因調(diào)控技術(shù)，在調(diào)控基因表達方面具有不可比擬的優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究領(lǐng)域[24-25]。應(yīng)用該技術(shù)探索和研究昆蟲的相關(guān)基因功能時發(fā)現(xiàn)，當在昆蟲發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的基因被沉默后，常會出現(xiàn)不同的組織表型[26-29]。Chen等[30]研究表明，當不同dsRNA之間沒有超過19 bp的連續(xù)相同的堿基，則說明dsRNA的片段特異性較強，對本試驗所用ds的cDNA片段進行比對后，發(fā)現(xiàn)它們之間的特異性均較強。當、和的dsRNA注射后48 h和72 h，RNAi都能抑制表達，表明這3個基因的干擾試驗是成功的（圖5）。PPO在表皮鞣化、硬化、黑化的過程中起著至關(guān)重要的作用，能夠促進表皮的硬化[31]，并通過鞣化或骨化作用使表皮變硬、變黑[32]。在脂肪體、表皮及翅中高表達，表明其在這些組織中具有潛在的功能（圖4）。

A：3個SfPPO合成dsRNA的cDNA區(qū)域比對An alignment of the nucleotide sequences of three SfPPOs in the region of the dsRNAs；B—D：注射48 h和72 h后3個SfPPO的相對表達量Relative expression of three SfPPOs after injection for 48 h and 72 h

昆蟲體內(nèi)存在很多能夠?qū)Σ≡a(chǎn)生免疫作用的物質(zhì)，如當昆蟲受到病原菌刺激后其體內(nèi)能有效誘導產(chǎn)生或增加抗菌肽、溶菌酶、凝集素和酚氧化酶等物質(zhì)[33-34]，以增強機體的免疫防御。酚氧化酶主要以酚氧化酶原的形式存在于昆蟲血淋巴中，當昆蟲受到外源物侵染后，其血淋巴中的酚氧化酶原就會被激活成為有活性的酚氧化酶。因此，昆蟲及無脊椎動物免疫能力的評價也常用酚氧化酶的含量及活性水平作為指標[35-36]。筆者早期針對菌誘導下酚氧化酶基因的mRNA水平進行了探究，發(fā)現(xiàn)當?shù)聡◇贡徊≡碳ず螅友趸富虻谋磉_水平會通過上調(diào)作為轉(zhuǎn)化的酚氧化酶原的可能補充形式[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌誘導后24 h，、和表達開始上調(diào)且與PBS誘導組差異最大（圖6），與在褐飛虱中的研究結(jié)果一致[14]。在大腸桿菌誘導之后，與PBS誘導組相比和在12 h即出現(xiàn)表達差異，24 h時差異最顯著；則在24 h開始出現(xiàn)表達差異且差異最顯著（圖6）。對褐飛虱的研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌誘導24 h時表達出現(xiàn)差異，而則無顯著變化[14]，與本研究結(jié)果略不相同，可能是由于昆蟲自身的差異導致。

圖6 SfPPO在菌誘導后的響應(yīng)情況

4 結(jié)論

白背飛虱的3個具有高度保守性，且與褐飛虱的具有較高的同源性；不同發(fā)育階段以及組織表達結(jié)果表明，白背飛虱的3個可能行使不同功能；ds注射能夠有效抑制的表達；病原菌誘導結(jié)果顯示，對于革蘭氏陰性菌和陽性菌的免疫應(yīng)答存在差異。

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Characteristics and Immune Response of Prophenoloxidase Genes in

ZHANG Daowei1, KANG Kui1, YU Yaya2, KUANG Fuping1, PAN Biying3, CHEN Jing2, TANG Bin1,3

(1College of Biology and Agriculture, Zunyi Normal University/Key Laboratory of Protection and Utilization of Animal Resource in Chishui River Basin, Zunyi 563006, Guizhou;2School of Basic Medical Science, Zunyi Medical University, Zunyi 563006, Guizhou;3College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

【】Phenoloxidase (PO) is an immune protein and plays an important regulatory role in insects. It exists as the form of inactive prophenoloxidase (PPO). In this study, based on the threesequences ofby transcriptome sequencing, thebiological functions ofwere further explored by analyzing the developmental and tissue expression patterns of different, suppressing the expression ofand inducing by pathogenic bacteria.【】Taking threesequences as research objects, the protein structure and homology with other insects were analyzed by bioinformatics method. In addition, dsRNA injected with green fluorescent protein (GFP) was used as a control group, and the inhibitory effect of target gene was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) after injecting with ds. In order to investigate the role ofin the growth and immune response of, qRT-PCR was used to detect the expression ofat different developmental stages and in different tissues, as well as the induced expression of threeafter injecting withand.【】The open reading frames (ORF) of,, andare 2 079, 999, and 2 070 bp in length, respectively, which encoding 692, 332, and 689 amino acids, respectively. The predicted protein molecular weights are 79.84, 37.67, and 79.53 kD, and the isoelectric points are 6.43, 9.56, and 6.20, respectively. Bioinformatics analysis showed that the three PPO proteins ofhad high homology and were closely related to.,andwere all highly expressed on the 3rd day of adult, and the developmental expression patterns ofandwere similar. The tissue expression results showed thatandwere highly expressed in the epidermis and fat body, whilewas highly expressed in the wing and fat body, and the expressions of all the three genes were relatively low in head, foot, midgut andmalpighian tubule. Compared with the dsgroup, injecting with the dsRNA of target gene could significantly silence the expression of target gene, and when theexpression was silenced,appeared to be significantly overexpressed, indicating that there might be compensatory function among different. The expression levels ofandwere significantly increased after 12 h of induction with, while the expression ofwas significantly increased after 24 h of induction. In addition, the expression levels of,andwere all significantly increased after 24 h of induction with.【】The expression of,andhas tissue and development specificity, and there are differences in immune response under the induction of different pathogenic bacteria. The results are helpful to explore the potential molecular mechanism of phenoloxidase in insect development and immunity.

; prophenoloxidase (PPO); RNA interference (RNAi); quantitative real-time PCR (qRT-PCR); inducible expression; immune response

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.011

2020-01-16；

2020-03-13

國家自然科學基金（31560511）、貴州省科學技術(shù)基金（黔科合JZ字[2014]2014號）

張道偉，E-mail：zhangdw1000@163.com。通信作者唐斌，Tel：0571-28865680；E-mail：tbzm611@163.com

（責任編輯 岳梅）