沈瑞華 程中一

(1.江蘇昌九農(nóng)科化工有限公司，江蘇 南通 226413；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

腈類化合物在自然界中分布廣泛，通常以氰苷化合物、氰基酯類化合物以及扁桃腈類化合物等形式存在于植物及昆蟲體內(nèi)。此外，人工合成的腈類化合物在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要的作用。然而，腈類化合物具有致畸致突變性，且對(duì)環(huán)境有一定的危害[1，2]。

自然界代謝腈類物質(zhì)主要通過三種酶進(jìn)行：腈水解酶(EC 3.5.5.1和3.5.5.7，nitrilase)、腈水合酶(EC 4.2.1.84，nitrile hydratase，NHase)和酰胺酶(EC 3.5.1.4，amidase)。腈水解酶可將腈類物質(zhì)一步催化生成相對(duì)應(yīng)的羧酸，而NHase可將腈類物質(zhì)催化生成對(duì)應(yīng)的酰胺類化合物，隨后在酰胺酶的作用下，進(jìn)一步生成對(duì)應(yīng)的羧酸[3](圖1)。

圖1 腈類代謝的主要途徑

1 NHase概述

酰胺類化合物可作為重要的有機(jī)合成中間體，在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。NHase是一類能夠水化腈類化合物中氰基合成對(duì)應(yīng)酰胺的金屬酶，按照活性中心結(jié)合的金屬離子不同可分為鐵型NHase(Fe-NHase)和鈷型NHase(Co-NHase)，NHase內(nèi)的金屬離子和活性中心高度保守的[-半胱氨酸(Cys)-半胱氨酸(Cys)-絲氨酸(Ser)-半胱氨酸(Cys)-]氨基酸基序構(gòu)成活性中心的爪狀結(jié)構(gòu)[4]。NHase的來源廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)的NHase主要來源于原核生物[5，6]。NHase含有α和β兩種亞基，一般以四聚體形式存在，原核生物來源的NHase中α和β兩種亞基以亞基分開的形式表達(dá)，2008年Foerstner等首次從真核生物領(lǐng)鞭毛蟲(Monosiga brevicollis)中發(fā)現(xiàn)亞基融合型的NHase，即α和β兩種亞基以單條肽鏈的形式表達(dá)[7](圖2)。

圖2 NHase基因型

由于生物催化劑通常具有反應(yīng)條件溫和，催化效率高，工藝環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，因此利用NHase生產(chǎn)酰胺類產(chǎn)品已逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法。Yamada等利用Rhodococcus sp.N-774，Pseudomonas chlororaphis B23以及Rhodococcus.rhodochrous J1來源的三代NHase成功地實(shí)現(xiàn)了丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)[8]。到目前為止，第三代工業(yè)菌株R.rhodochrous J1在丙烯酰胺的生產(chǎn)中已經(jīng)占據(jù)了主導(dǎo)地位。國(guó)內(nèi)沈寅初、鄭裕國(guó)團(tuán)隊(duì)以及沈忠耀團(tuán)隊(duì)亦開發(fā)并優(yōu)化了多種基于NHase的丙烯酰胺生產(chǎn)菌株，極大推動(dòng)了我國(guó)NHase的產(chǎn)業(yè)化[9，10]。

NHase在國(guó)內(nèi)主要用于煙酰胺及丙烯酰胺的生產(chǎn)。煙酰胺屬于B族維生素，在醫(yī)藥領(lǐng)域中用來預(yù)防糙皮病，也用來作為食品和飼料添加劑，近年來亦作為護(hù)膚品原料廣泛應(yīng)用在美容行業(yè)。丙烯酰胺是一種重要的大宗化學(xué)品，在石油開采、污水處理及制漿造紙等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。然而，NHase在工業(yè)生產(chǎn)過程中存在著穩(wěn)定性較差的問題，例如，來源于Pseudomonas chlororaphils B23、R.rhodochrous J1以及Rhodococcus sp.N-774的NHase僅在20 ℃以下保持較高的酶活性[11-13]。

對(duì)于大多數(shù)工業(yè)酶，反應(yīng)速度往往隨著催化溫度增加而顯著提高，但是酶在較高溫度下會(huì)因構(gòu)象變化逐漸失活[14]。NHase在工業(yè)應(yīng)用過程中熱穩(wěn)定性不高，而腈類的水合過程屬于放熱反應(yīng)，所以在工業(yè)催化過程中，需要對(duì)反應(yīng)釜進(jìn)行冷卻降溫，能耗較大；此外，NHase的不穩(wěn)定還體現(xiàn)在對(duì)高濃度腈類底物和酰胺類產(chǎn)物耐受性差，這往往導(dǎo)致NHase失活，從而使得產(chǎn)物丙烯酰胺濃度只能維持較低的水平，給后續(xù)的丙烯酰胺濃縮工藝帶來影響。隨著市場(chǎng)的不斷拓展，酰胺類化合物的需求也日益劇增，因此如何提高NHase的熱穩(wěn)定性及產(chǎn)物耐受性已成為研究重點(diǎn)[15]。

獲得高穩(wěn)定性NHase的方法主要有篩選自然界中天然存在的高穩(wěn)定性NHase和改造現(xiàn)有的NHase。挖掘新酶具有重要意義，不僅有可能篩選出耐高溫耐有機(jī)溶劑的新型NHase，還能為研究者們改造現(xiàn)有NHase提供新的方向。挖掘嗜熱微生物來源的NHase以及對(duì)NHase進(jìn)行體外定向進(jìn)化同樣能夠篩選穩(wěn)定性提升的突變體，以實(shí)現(xiàn)工業(yè)菌株的更新?lián)Q代。近年來，多種分子改造策略已被用于提高NHase的穩(wěn)定性，例如增設(shè)鹽橋[16]、降低自由能[17]、同源片段交換[18]、基因融合[19]等(圖3)。這些策略為工業(yè)用酶的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

圖3 NHase熱穩(wěn)定性改造方法

2 NHase的區(qū)域選擇性

與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，NHase在催化腈類底物時(shí)展現(xiàn)出一定的區(qū)域選擇性[20]。NHase對(duì)于腈類底物的區(qū)域選擇性目前主要體現(xiàn)在催化二腈類底物上，即NHase能選擇性地水合二腈底物中的一個(gè)氰基，使其轉(zhuǎn)化成氰基單酰胺，亦或先后將二腈類底物中的兩個(gè)氰基全部水合，生成二酰胺終產(chǎn)物[21-23](圖4)。

圖4 NHase的區(qū)域選擇性

NHase區(qū)域選擇性催化二腈類底物最具代表性的例子為水化己二腈生產(chǎn)5-氰基戊酰胺或己二酰胺[24，25]。5-氰基戊酰胺可以作為農(nóng)藥唑啉酮類除草劑的生產(chǎn)前體，也可以用于合成己內(nèi)酰胺；己二酰胺則可以作為多種藥物的合成砌塊[26]。Shen等研究發(fā)現(xiàn)赤紅球菌Rhodococcus.ruber CGMCC3090來源的NHase能夠催化己二腈生成5-氰基戊酰胺，區(qū)域選擇性達(dá)到99%，而來源于睪丸酮叢毛單胞菌Comamonas.testosteroni 5-MGAM-4D的NHase能夠?qū)⒓憾嫱耆D(zhuǎn)化為己二酰胺終產(chǎn)物[27]。此外，有研究已經(jīng)報(bào)道了分離自嗜酸紅球菌Rhodococcus.aetherivorans ZJB1208的NHase能夠催化1-氰基環(huán)己基乙腈生成1-氰基環(huán)己基乙酰胺，產(chǎn)物得率(產(chǎn)物質(zhì)量/催化劑用量)達(dá)到204.2[28]。

近年來，研究人員雖然已經(jīng)分離出了一些含有區(qū)域選擇性NHase的菌株(表1)，但對(duì)于NHase展現(xiàn)出區(qū)域選擇性的原因還未有定論，且通過蛋白質(zhì)工程手段改造NHase對(duì)于二腈類底物區(qū)域選擇性的研究也較少。最近，Cheng等通過序列比對(duì)方式，發(fā)現(xiàn)來源于睪丸酮叢毛單胞菌C.testosteroni 5-MGAM-4D的NHase與來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas.Putida NRRL-18668的NHase具有95%以上的序列相似度，但兩者對(duì)于二腈類底物的區(qū)域選擇性完全不同。通過同源建模、底物通道計(jì)算等計(jì)算機(jī)技術(shù)的輔助，研究人員發(fā)現(xiàn)了位于NHase底物通道上的βPhe37關(guān)鍵氨基酸殘基，該位點(diǎn)可以作為“開關(guān)”調(diào)控NHase的區(qū)域選擇性。在該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以翻轉(zhuǎn)該酶對(duì)于脂肪族二腈類底物的區(qū)域選擇性[29]。除此之外，Cheng等通過分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬，定位了NHase底物結(jié)合口袋中潛在影響NHase區(qū)域選擇性的關(guān)鍵氨基酸殘基，并基于迭代飽和突變，篩選到βY68T/W72Y優(yōu)勢(shì)突變體，該突變體較野生型NHase展現(xiàn)出完全相反的區(qū)域選擇性[30]。這些發(fā)現(xiàn)闡明了NHase底物通道及底物結(jié)合口袋構(gòu)成氨基酸對(duì)于NHase催化二腈類底物區(qū)域選擇性的關(guān)鍵作用，可以為今后改造NHase催化其他含有兩個(gè)以上腈基的腈類底物的區(qū)域選擇性提供一定的理論依據(jù)。

表1 近五年報(bào)道的具有區(qū)域選擇性的NHase

3 NHase的對(duì)映選擇性

近些年，利用酶分子進(jìn)行不對(duì)稱催化已經(jīng)成為有機(jī)合成領(lǐng)域的熱門研究方向之一。手性酰胺類產(chǎn)品廣泛存在于天然產(chǎn)物、藥物和各種生物活性化合物中，如抗細(xì)胞增殖劑、抗生素頭孢孟多和緩激肽拮抗劑藥物等，在抑制腫瘤發(fā)展、治療細(xì)菌感染及抗過敏等方面有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值[31-33]。此外，手性酰胺可以作為重要的有機(jī)合成砌塊制備結(jié)構(gòu)多樣的藥理活性分子，如具有抗休克及強(qiáng)心作用的氨基醇衍生物、具有殺菌作用的烷氧基酰胺及氨基酸衍生物等[34]?；谑中怎０吩谥扑幍阮I(lǐng)域的巨大工業(yè)價(jià)值，研究人員對(duì)手性酰胺不對(duì)稱合成的方法學(xué)進(jìn)行了較為深入的研究，開發(fā)出了多種制備方法，主要分為化學(xué)合成法與生物催化法。然而，化學(xué)合成法的反應(yīng)條件往往較為苛刻，且存在對(duì)映選擇性差、催化活性低和底物譜窄等缺點(diǎn)。相較于化學(xué)合成法，生物催化法具有反應(yīng)條件溫和及副產(chǎn)物少等優(yōu)勢(shì)。NHase能夠催化腈類化合物水合生成相應(yīng)的酰胺類化合物，在不對(duì)稱合成手性酰胺方面有著較大的應(yīng)用潛力。

近年來，一些NHase在合成酰胺類化合物過程中，展現(xiàn)出一定的對(duì)映選擇性。具有對(duì)映選擇性的NHase主要分布在農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、沙雷菌屬(Serratia)、紅球菌屬(Rhodococcus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)中[5]。Fallon等發(fā)現(xiàn)來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas putida 5B的NHase能夠催化α-異丙基對(duì)氯苯基乙腈生成對(duì)應(yīng)的S型酰胺產(chǎn)物，對(duì)映體過量值(ee值)達(dá)到90%以上[35]。國(guó)內(nèi)王梅祥課題組發(fā)現(xiàn)來源于紅球菌Rhodococcus sp.AJ270的NHase能夠選擇性地催化α-取代苯乙腈類底物生成對(duì)應(yīng)的手性酰胺類產(chǎn)物[36]。此外，Pawar等將來源于玫瑰色紅球菌R.rhodochrous ATCC BAA-870的NHase和聚乙烯醇/殼聚糖-戊二醛相交聯(lián)，得到的固定化NHase對(duì)于(R)-扁桃腈的對(duì)映體過量值(ee值)達(dá)到了81%[37]。國(guó)內(nèi)楊立榮課題組發(fā)現(xiàn)來源于產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca KCTC 1686的NHase能催化扁桃腈不對(duì)稱合成(S)-扁桃酰胺，對(duì)映體比率(E值)為14[38]。還有一些其他來源的NHase對(duì)于不同的外消旋腈類底物也顯示出了不同的對(duì)映選擇性或立體選擇性[39]。值得注意的是，現(xiàn)有關(guān)NHase對(duì)映選擇性的研究主要集中于篩選含有對(duì)映選擇性NHase的菌株上，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道通過蛋白質(zhì)工程手段改造NHase的對(duì)映選擇性。

酶分子的對(duì)映選擇性是由底物結(jié)合、反應(yīng)能壘等各因素共同作用的結(jié)果，而酶的底物結(jié)合口袋及底物通道的構(gòu)象對(duì)于底物結(jié)合及反應(yīng)能壘有著重要影響。酶的底物結(jié)合口袋往往具有一種特定的構(gòu)象，使得酶分子催化的反應(yīng)偏好生成一種特定的產(chǎn)物對(duì)映體，而酶的底物通道通常在底物與酶分子的結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，影響底物在結(jié)合口袋中的空間取向，進(jìn)而使酶分子具有一定的對(duì)映選擇性。通過一定的酶分子改造手段，在底物結(jié)合口袋或底物通道引入突變，往往能夠?qū)崿F(xiàn)酶分子對(duì)映選擇性的調(diào)控，使酶分子優(yōu)先形成所需的對(duì)映體，甚至實(shí)現(xiàn)對(duì)映選擇性的逆轉(zhuǎn)[40]。因此，選用高效可靠的酶分子改造手段重構(gòu)酶底物結(jié)合口袋及底物通道構(gòu)象，對(duì)于提升酶不對(duì)稱催化的性能、解析酶的對(duì)映選擇性機(jī)制具有重要意義。

最近，Cheng等報(bào)道了一種用于改造NHase對(duì)映選擇性的半理性設(shè)計(jì)方法。通過將分子對(duì)接、底物通道計(jì)算和拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬相結(jié)合，研究人員成功定位到來源于R.rhodochrous J1的L-NHase中的βPhe37氨基酸殘基，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變后，該酶不對(duì)稱合成(S)-扁桃酰胺的ee值從52.6%提升至96.8%。在此基礎(chǔ)上，綜合計(jì)算機(jī)輔助分析，研究人員發(fā)現(xiàn)具有不同手性的對(duì)映體在通過NHase底物通道過程中所受的空位阻礙不同，從而進(jìn)一步影響了配體在底物結(jié)合口袋中的最終取向[41]。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于指導(dǎo)基于半理性設(shè)計(jì)的酶分子改造有一定的理論意義。

4 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過研究人員多年的努力，目前已有多種來源的NHase被成功分離并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的表征。同時(shí)，亦有多種NHase經(jīng)過蛋白質(zhì)工程的改造在穩(wěn)定性及活性等方面有了質(zhì)的提升。NHase的應(yīng)用已經(jīng)不再限于傳統(tǒng)的大宗化學(xué)品合成領(lǐng)域，未來該酶在精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥及高附加值藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用將把NHase的發(fā)展推入新的紀(jì)元。在這一過程中，NHase仍有面臨底物譜不寬泛、穩(wěn)定性低等問題，但隨著蛋白質(zhì)工程及生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，NHase這一綠色催化劑將在生物化工領(lǐng)域繼續(xù)發(fā)光。