★ 馬艷靜 張金蓮* 任洪民 夏瀾婷 王婷 林新明（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬草本植物，富含多糖、生物堿、微量元素及人體必需的氨基酸等生物活性物質(zhì)［1］，有醫(yī)療與保健雙重功效，位列“九大仙草”之首［2］。其干燥莖入藥為鐵皮石斛，收載于《中國藥典》2015年版鐵皮石斛項(xiàng)下，具有益胃生津，滋陰清熱之功；其花、葉常制成茶使用，不僅可提高鐵皮石斛資源的綜合利用率，而且可更好的發(fā)揮鐵皮石斛的藥用價值和保健作用。但是目前市場上鐵皮石斛葉茶的制備方法不一，工藝參數(shù)寬泛，導(dǎo)致品質(zhì)差異大，且目前未見有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本文擬通過比較兩種制備工藝所得鐵皮石斛茶的品質(zhì)，優(yōu)選出較優(yōu)的一種，并進(jìn)一步采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化，為促進(jìn)珍稀藥材鐵皮石斛新產(chǎn)品的開發(fā)及鐵皮石斛茶的制法的規(guī)范化提供一定參考。

1 材料

1.1 藥材 鐵皮石斛鮮葉由江西省上饒縣茶亭鎮(zhèn)松坪村鐵皮石斛種植基地1、基地2提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）的葉。

1.2 儀器 752-紫外分光光度計(jì)（上海光華儀器廠），微波爐（美的集團(tuán)有限公司），GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），炒鍋（美的集團(tuán)有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），SXT-06索氏提取器（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試藥 D-甘露糖對照品（純度98%，批號：wkq16092307），石斛堿對照品（純度98%，批號：wkq18012501），蘆丁對照品（純度98%，批號：wkq17041004），對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司。苯酚，硫酸，無水乙醇，三氯甲烷，鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，溴甲酚綠溶液，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，所有試劑均為分析純。娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 制備工藝1 1）沖洗晾干。將不同產(chǎn)地的鐵皮石斛鮮葉用流水沖洗，沖洗干凈后將鐵皮石斛葉均勻攤開，在陰涼避光處晾干。

2）炒青。將晾干鐵皮石斛葉利用人工雙手在鐵鍋里炒制至不再出汁為止，鐵皮石斛葉經(jīng)炒青后，經(jīng)過手工揉搓成條索狀，即得殺青后鐵皮石斛茶葉，備用。

3）干燥。將殺青后的鐵皮石斛茶葉置于干燥箱內(nèi)，于低溫慢焙干即可。

2.1.2 制備工藝2 1）攤放。將鐵皮石斛鮮葉洗凈后均勻攤放，置于陰涼通風(fēng)室內(nèi)，攤放至柔軟。

2）殺青。將鮮葉使用微波爐殺青后及時倒入竹匾內(nèi)，攤晾。

3）炒制干燥。將殺青葉均勻抖散入炒鍋內(nèi)，進(jìn)行手工炒制，再用干燥箱進(jìn)行干燥，干透即得。

2.2 鐵皮石斛茶葉的質(zhì)量比較

2.2.1 多糖含量測定［3］

2.2.1.1 供試品溶液的制備 將制備好的鐵皮石斛茶葉放于干燥器內(nèi)；精密稱取碾碎后的不同產(chǎn)地鐵皮石斛葉或茶葉各0.2 g，加純水10 mL，在40 ℃、50 Hz的超聲波條件下超聲提取30 min；續(xù)提1次，過濾，55 ℃濃縮至晶體，定容至10 mL，用40 mL無水乙醇進(jìn)行醇析，4 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加純水25 mL溶解，加savage試劑25 mL除去蛋白、核酸等雜質(zhì)，1 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL置于25 mL容量瓶中，純水定容，即得多糖提取液。

2.2.1.2 多糖含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定D-葡萄糖對照品20 mg，置于100 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。精密移取對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入現(xiàn)配的5%苯酚溶液1.0 mL、搖勻，再加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置5 min，90℃沸水浴30 min，冷卻至室溫，以水為空白，于490 nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=9.708 6X+0.105 6，r=0.999 8。另取“2.2.1.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液1.0 mL，自“加水至2 mL開始”，依法測定其吸光度，計(jì)算多糖的含量（以葡萄糖計(jì)），結(jié)果見表1。

2.2.2 總生物堿含量測定［4］

2.2.2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取制備好鐵皮石斛茶葉各0.4 g，碾碎后，用濾紙包好，于250 mL索氏提取器中，以三氯甲烷100 mL為溶劑，80 ℃回流提取90 min，將提取液濃縮至10 mL，即得葉的總生物堿提取液。

2.2.2.2 總生物堿含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取1mg的石斛堿對照品，置于100 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于60 mL的分液漏斗中，加三氯甲烷至10 mL，再加鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液（pH 4.5）5.0 mL、0.04%溴甲酚綠溶液2.0 mL，劇烈振搖5 min后靜置30 min，分液。取三氯甲烷層清液5.0 mL，加入0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液1.0 mL，搖勻，于620 nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，石斛堿濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.307 4X-0.026 9，r=0.999 1。另取“2.2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，自“再加鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液（pH 4.5）5.0 mL”起，依法測定其吸光度，計(jì)算總生物堿的含量，結(jié)果見表1。

2.2.3 總黃酮含量測定［5］

2.2.3.1 樣品溶液的制備 分別稱取鐵皮石斛茶葉0.2 g，碾碎后按料液比1∶20加入65%乙醇，在70 ℃、50 Hz的超聲波條件下超聲提取30 min；續(xù)提1次，過濾，合并濾液，30 %乙醇定容至25 mL，得葉的總黃酮提取液。

2.2.3.2 總黃酮含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定20 mg蘆丁對照品，置于100 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。精密移取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，加純水至10 mL，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min后再加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液20 mL，混勻，于510 nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，總黃酮濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.005 8X+0.000 2，r=0.999 5。另取“2.3.3.1”項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，自“加水至10 mL開始”，依法測定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見表1。

2.2.4 感觀指標(biāo)確定 將兩種制備工藝的鐵皮石斛茶采用相同的方法進(jìn)行泡制成茶水，請20位有品茶經(jīng)驗(yàn)者進(jìn)行品鑒，確定色澤及口感的優(yōu)劣。

表1 不同制備工藝鐵皮石斛茶品質(zhì)的比較（n=3）

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選 從“2.2”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備工藝2的定性指標(biāo)及多糖、總生物堿、總黃酮含量等定量指標(biāo)均優(yōu)于制備工藝1。為得到更好品質(zhì)的鐵皮石斛茶，有必要對制備工藝2的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行細(xì)化和優(yōu)化，故進(jìn)一步以基地1鐵皮石斛葉為研究對象。采用Box-Behnken 效應(yīng)面試驗(yàn)［6-12］，結(jié)合前期單因素研究的結(jié)果，選擇攤放時間（A）、微波殺青時間（B）、干燥時間（C）及干燥溫度（D）為考察因素，以多糖、總生物堿、總黃酮含量的考察指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken效應(yīng)面法試驗(yàn)，因素水平表2，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

表2 鐵皮石斛茶葉的提取工藝優(yōu)選Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

表3 鐵皮石斛茶葉的提取工藝優(yōu)選Box-Behnken試驗(yàn)試驗(yàn)安排

以多糖含量（Y1）、總生物堿含量（Y2）、總黃酮含量（Y3）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：Y1=+0.31+0.100A-2.500E-003B-0.012C+5.833E-003D-2.500E-003AB-2.500EAC-0.025AD+5.000E-003BC+0.020BD-7.500E-003CD-0.11A2-0.064B2-0.073C2-0.054D2（ 相 關(guān) 系 數(shù)r=0.9573），Y2=+4.28-0.23A-0.11B-0.068C+0.082D+0.037AB-0.040AC-0.19AD-0.022BC+0.098BD-0.10CD-1.13A2-0.14B2-0.16C2-0.28D2（ 相 關(guān) 系 數(shù)r=0.9767），Y3=+63.58+0.62A+1.31B-0.17C-0.16D+0.22AB-1.53AC-0.60AD-2.84BC+1.58BD-0.12CD-32.61A2-10.82B2-14.32C2-14.16D2（相關(guān)系數(shù)r=0.9586），說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對鐵皮石斛茶提取進(jìn)行分析和預(yù)測。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表 4～6。

表4 多糖含量回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

表5 總生物堿含量回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

表6 總黃酮含量回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

由表4-6可知，鐵皮石斛茶葉多糖、總生物堿及總黃酮含量提取率達(dá)極顯著水平， 二次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)達(dá)極顯顯著水平，回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾小。擬合檢驗(yàn)極顯著，說明以上方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了多糖、總生物堿及總黃酮含量與攤放時間、微波殺青、干燥時間及干燥溫度的關(guān)系。因此，所得方程能較好的預(yù)測鐵皮石斛茶葉多糖、總生物堿及總黃酮各參數(shù)的變化規(guī)律。采用Design-Expert軟件作出相應(yīng)的曲面圖和等高線圖，見圖1-6。

圖1 微波殺青與攤放時間對多糖含量影響等高線

圖2 微波殺青與攤放時間對多糖含量影響效應(yīng)面

圖3 干燥溫度與攤放時間對總生物堿含量影響等高線

圖4 干燥溫度與攤放時間對總生物堿含量影響效應(yīng)面

圖5 微波殺青與攤放時間對總黃酮含量影響等高線

圖6 微波殺青與攤放時間對總黃酮含量影響效應(yīng)面

由圖1-2可知，隨著攤放時間及微波殺青時間的變化，最佳多糖含量為攤放時間8 h、微波殺青70 s時多糖含量最高，圖3-4可知，最佳總生物堿含量為干燥溫度與攤放時間分別為70 ℃、8 h，圖5-6可知，最佳總黃酮含量為微波殺青與攤放時間分別為70 s、8 h。以多糖、總生物堿及總黃酮含量均是在干燥時間、干燥溫度分別為5 h、70 ℃含量較優(yōu)。根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸模型的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，預(yù)測最佳工藝為攤放8 h，微波殺青70 s，70 ℃烘箱中干燥5 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 取同一批次的鐵皮石斛葉，平行3份，按預(yù)測最佳工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果鐵皮石斛茶多糖、總生物堿及總黃酮含量分別為0.33、4.38及68.22，RSD值分別為1.57%、1.05%及1.03%，偏差率不顯著，表明所建立的模型具有良好預(yù)測性，優(yōu)選的工藝重復(fù)性良好。

3 小結(jié)

生長環(huán)境對鐵皮石斛的品質(zhì)影響很大，本文以兩個基地所產(chǎn)鐵皮石斛葉為研究對象，分別采用兩種工藝進(jìn)行加工，并以多糖、總生物堿、總黃酮的含量及感觀為指標(biāo)進(jìn)行比較加工成品的質(zhì)量，結(jié)果顯示，石斛茶多糖含量：基地1＞基地2，總生物堿及總黃酮含量：基地1＜基地2，有學(xué)者認(rèn)為多糖為鐵皮石斛中最主要的藥效成分，也有學(xué)者認(rèn)為總生物堿及總黃酮也有的藥用價值，故哪個基地的鐵皮石斛葉哪個更優(yōu)，這有待進(jìn)一步研究。

由于實(shí)驗(yàn)影響因素多，難以實(shí)現(xiàn)采用 Box-Behnken效應(yīng)面法考察全部因素，因此，我們前期采用預(yù)試驗(yàn)對一些較重要的工藝因素如攤放時間、微波殺青、干燥時間及干燥溫度進(jìn)行單因素考察，再采用Box-Behnken 效應(yīng)面法考察這幾因素對鐵皮石斛茶制備工藝的影響，結(jié)果得較優(yōu)的鐵皮石斛茶制備工藝參數(shù)為：在溫度為20 ℃～25 ℃范圍內(nèi)，以1.0 cm的厚度攤放8 h，微波功率為800 W，投葉量為100 g，厚度為1.0 cm進(jìn)行殺青，其中殺青時間為70 s時可達(dá)到最佳的殺青效果，并獲得較高的多糖、總生物堿及總黃酮含量；干燥時，用電炒鍋進(jìn)行，投葉量為100～150 g，下鍋溫度約為110 ℃，炒制至不再出汁，將炒制后的鐵皮石斛葉放置在70 ℃烘箱中干燥5 h，經(jīng)3批樣品的驗(yàn)證，顯示預(yù)測性較好，為鐵皮石斛茶的加工規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化提供一定的技術(shù)支持。