周海珍 , 李墨非

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 地球科學(xué)學(xué)院, 北京 100049)

殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellapiscicida)，原名遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)是一種革蘭氏陰性病原菌，可感染魚(yú)類(lèi)、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和人類(lèi)[1]。由殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌引發(fā)的愛(ài)德華氏菌病給我國(guó)多種重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖，如牙鲆、大菱鲆、鰻鱺和真鯛等造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近年來(lái)，對(duì)于殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌致病機(jī)制的研究取得了一系列進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)多種毒力系統(tǒng)和致病因子，如，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)[3]、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)[4]、群體感應(yīng)系統(tǒng)[5]等。這些毒力因子在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌黏附、侵染及在宿主細(xì)胞中存活起著重要的作用[6]。但是目前我們對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的感染機(jī)制，包括在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存與復(fù)制機(jī)制等，仍不清楚。

細(xì)菌sRNA長(zhǎng)度約為50～500 nt，能轉(zhuǎn)錄但不能翻譯，通過(guò)堿基配對(duì)的方式調(diào)控靶基因mRNA的翻譯及穩(wěn)定性[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌非編碼小RNA(Small non-coding RNA，sRNA)作為一種調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)菌環(huán)境應(yīng)答、生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性和致病性等生物學(xué)過(guò)程[8-9]。在愛(ài)德華氏菌的研究中，Sun等[10]通過(guò)RNA測(cè)序和qRT-PCR法鑒定了E.tardaS08的10個(gè)sRNA (ET_sRNA_1至ET_sRNA_10)。TargetRNA2靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明這10個(gè)sRNA的靶基因均直接或間接與毒力相關(guān)，說(shuō)明它們可能參與調(diào)控遲緩愛(ài)德華氏菌的毒力[10]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌TXD1在不同生長(zhǎng)環(huán)境(正常LB培養(yǎng)、酸性脅迫、缺鐵脅迫和氧化脅迫)下共有148個(gè)sRNA表達(dá)。相比正常LB培養(yǎng)組，共有103個(gè)sRNA在3種脅迫環(huán)境下有顯著差異表達(dá)。IntaRNA預(yù)測(cè)結(jié)果表明，這103個(gè)sRNA共調(diào)節(jié)769個(gè)靶基因，這些潛在靶基因廣泛參與細(xì)菌的致病性調(diào)節(jié)與抗逆性等多種生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)前期RNA測(cè)序結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，選取在酸性條件下具有差異表達(dá)的一個(gè)sRNA即sR082進(jìn)行深入研究[11]。通過(guò)比較sR082敲除株TXΔsR082與TXD1在不同pH值條件下的生長(zhǎng)速率、侵染牙鲆鰓細(xì)胞系(FG cell lines)和對(duì)牙鲆致死能力的差異，探討sR082在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌感染魚(yú)類(lèi)過(guò)程中發(fā)揮的作用，以期為闡明殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的胞內(nèi)生存機(jī)制和致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌TXD1為本實(shí)驗(yàn)室保存[12]，敲除株TXΔsR082利用同源重組方法(In-frame deletion)構(gòu)建[11]，使用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)。所用抗生素為多黏菌素B(polyB)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康牙鲆購(gòu)自青島膠南(青島龍灣生物科技有限公司古鎮(zhèn)營(yíng)養(yǎng)殖場(chǎng))養(yǎng)殖場(chǎng)，牙鲆均重約30 g，在實(shí)驗(yàn)室條件下(充氣海水，21 ℃，每日換水1次，每日喂食商品化顆粒飼料)暫養(yǎng)2周后，用于實(shí)驗(yàn)。所有魚(yú)在實(shí)驗(yàn)之前用魚(yú)安定麻醉。

1.3 sR082在不同pH值條件下的表達(dá)分析

E.piscicidaTXD1劃線于固體LB平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于含polyB的LB培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，離心收集菌體，用PBS清洗2遍，分別接種至pH 7、pH 6和pH 5的LB培養(yǎng)基中，終濃度為1×106CFU/mL，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)。使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，收集OD600=0.2，OD600=0.4，OD600=0.7和OD600=0.9的細(xì)菌。每個(gè)樣品取2×109CFU細(xì)菌，離心去培養(yǎng)基，加入500 μL Trizol(InvitrogenTM)，放入液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。樣品全部收集完后，提取總RNA，NanoDrop2000測(cè)定純度和濃度。每個(gè)樣品取1000 ng RNA用Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用sR082RTF(5′-AACGGGCGGTGCTACTAAATC-3′)和sR082RTR(5′-TGGCTTTGTGGTTGTGATGTTG-3′)引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)使用引物16S rRNA F(5′-ACTGAGACACGGTCCAGA CTCCTAC-3′)和16S rRNA R(5′-TTAACGTTCACACCTTCCT CCCTAC-3′)檢測(cè)內(nèi)參基因16S rRNA[13]。

1.4 TXD1和TXΔsR082在不同pH值環(huán)境壓力下生長(zhǎng)曲線測(cè)定

按上述方法培養(yǎng)TXD1和TXΔsR082，接種于pH 7、pH 6和pH 5的LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定OD600吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 TXD1和TXΔsR082在FG細(xì)胞系內(nèi)復(fù)制能力檢測(cè)

將FG細(xì)胞用Leibovitz′s-15(L-15)培養(yǎng)基(含10% FBS)復(fù)蘇傳代后，鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，23 ℃，過(guò)夜培養(yǎng)。用TXD1和TXΔsR082菌株以MOI為30∶1的比例侵染FG細(xì)胞2 h，用PBS洗3遍，然后用200 mg/mL慶大霉素殺胞外菌1 h，PBS洗3遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完的細(xì)胞用1% Triton X-100裂解，梯度稀釋?zhuān)縇B固體平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。此為侵染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

胞內(nèi)復(fù)制實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法前期與侵染實(shí)驗(yàn)相同，殺胞外菌結(jié)束后，向不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞中加入含30 mg/mL慶大霉素的L-15培養(yǎng)基，維持胞外無(wú)菌環(huán)境。孵育2、4、6和8 h后，吸干各個(gè)時(shí)間孔中的培養(yǎng)液，PBS洗3遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TXD1和TXΔsR082組織侵染和致死率分析

組織侵染實(shí)驗(yàn)。將TXD1和TXΔsR082培養(yǎng)至OD600≈0.6。用PBS洗3遍，并用PBS重懸至1×107CFU/mL。將60條牙鲆隨機(jī)分為2組，每組30條魚(yú)，分別肌肉注射100 μL(注射劑量為1×106CFU/條)TXD1和TXΔsR082。感染12、24和48 h后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取9條魚(yú)的腎臟和脾臟，3條魚(yú)的樣品混為1組，共3組，加入無(wú)菌PBS研磨后，梯度稀釋涂到固體LB平板上。28 ℃培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

致死率分析。將40條牙鲆隨機(jī)分為2組，每組20條魚(yú)，按照上述方法分別人工感染TXD1和TXΔsR082，每日監(jiān)測(cè)牙鲆死亡數(shù)目，共監(jiān)測(cè)15 d，計(jì)算每組魚(yú)的累積死亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Graphpad Prism 7.0軟件作圖。樣本間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值條件下sR082的表達(dá)情況

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)sR082可能與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌耐受酸性環(huán)境脅迫的能力有關(guān)[11]。為分析sR082在酸性條件下的轉(zhuǎn)錄情況，用qRT-PCR方法檢測(cè)不同pH值環(huán)境條件下，sR082在細(xì)菌不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，sR082在細(xì)菌培養(yǎng)至OD600= 0.2時(shí)含量最高，隨著細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的增加，含量逐漸降低。在細(xì)菌培養(yǎng)至OD600= 0.4時(shí)，sR082在pH 5條件下含量比在pH 7時(shí)上調(diào)約1.8倍；在細(xì)菌培養(yǎng)至OD600= 0.9時(shí)，sR082在pH 5條件下含量比在pH 7時(shí)上調(diào)1.9倍，而在pH 6的條件下含量相比pH 7條件下沒(méi)有明顯變化(圖1)。

“*”表示在OD600= 0.4時(shí)，sR082在pH 5中的含量與pH 7相比存在顯著差異(P<0.05)；“**”表示在OD600= 0.9時(shí)，sR082在pH 5中的含量與pH 7相比存在極顯著差異(P<0.01)

2.2 TXD1和TXΔsR082在不同pH值條件下的生長(zhǎng)情況

為進(jìn)一步探究sR082與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌酸性環(huán)境適應(yīng)性之間的關(guān)系，我們采用前期研究中構(gòu)建的殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌sR082敲除株TXΔsR082[19]，檢測(cè)其與野生株在不同pH值下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，在pH 7時(shí)，敲除株TXΔsR082和野生株TXD1相比生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)基本一致(圖2-A)；在pH 6時(shí)，8 h之后，TXΔsR082生長(zhǎng)速度降低(圖2-B)；在pH 5時(shí)，TXΔsR082與TXD1相比生長(zhǎng)速度顯著降低(圖2-C)。

A：pH 7時(shí)TXD1和TXΔsR082的生長(zhǎng)情況； B：pH 6時(shí)TXD1和TXΔsR082的生長(zhǎng)情況； C：pH 5時(shí)TXD1和TXΔsR082的生長(zhǎng)情況

2.3 TXD1和TXΔsR082感染牙鲆鰓細(xì)胞(FG)及胞內(nèi)復(fù)制能力分析

為研究sR082對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌侵染宿主細(xì)胞能力的影響，我們采用FG細(xì)胞檢測(cè) TXD1和 TXΔsR082侵染細(xì)胞能力和在宿主胞內(nèi)復(fù)制能力的差異。結(jié)果表明，與TXD1相比，TXΔsR082侵染至FG細(xì)胞的數(shù)量顯著降低(圖3-A)；同時(shí)在FG細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力顯著降低(圖3-B)。在感染6 h時(shí)，TXD1與TXΔsR082的胞內(nèi)菌量最多，并且兩者之間的差異也達(dá)到最大值(圖3-B)。

A：TXD1和TXΔsR082侵染FG細(xì)胞，“*”表示與TXD1相比，TXΔsR082侵染FG細(xì)胞能力顯著降低(P<0.05)；B：TXD1和TXΔsR082在FG細(xì)胞中的復(fù)制能力

2.4 TXD1和TXΔsR082在牙鲆組織中的侵染能力以及對(duì)宿主的致死率比較

為分析sR082對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌侵染魚(yú)體的影響，本研究用TXD1和TXΔsR082肌肉注射牙鲆。結(jié)果表明，在感染12 h，TXΔsR082在牙鲆腎臟中的數(shù)量極顯著低于TXD1，而在感染24 h和48 h后，TXΔsR082在牙鲆脾臟和腎臟中的數(shù)量均顯著低于TXD1(圖4)。

致死率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在感染TXD1后，牙鲆在第6天死亡率為100%，而TXΔsR082的感染致死率為20%，與TXD1相比，TXΔsR082致死率顯著降低(圖5)。

“*”表示與TXD1相比有顯著性差異(P<0.05)；“**”表示與TXD1相比有極顯著差異(P<0.01)

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)sRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種生理活動(dòng)，在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境刺激(如氧化壓力、溫度和酸堿等)和毒力方面發(fā)揮重要作用[14]。細(xì)菌侵染宿主后，宿主吞噬細(xì)胞對(duì)侵染的病原菌進(jìn)行吞噬，產(chǎn)生對(duì)病原菌不利的酸化環(huán)境、進(jìn)而產(chǎn)生自由基如活性氧和活性氮等對(duì)病原菌進(jìn)行殺傷[15]。細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)這些不利環(huán)境，產(chǎn)生一些sRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而增加其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存。例如過(guò)量表達(dá)酸性相關(guān)sRNA可以增強(qiáng)沙門(mén)氏桿菌的酸性耐受、致死率和對(duì)于上皮細(xì)胞系的黏附和侵染[16]；在乳酸鏈球菌中，敲除sRNA s042和s015能夠顯著抑制乳酸鏈球菌在酸性條件下的生長(zhǎng)[17-18]；大腸桿菌通過(guò)sRNA ArcZ、DsrA和 RprA調(diào)控rpoS基因增強(qiáng)其在酸性條件下存活能力[19]。前期測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌在酸性、缺鐵和過(guò)氧化氫脅迫條件下差異表達(dá)的103個(gè)sRNA, 這些sRNA預(yù)測(cè)調(diào)控769個(gè)靶基因的表達(dá)，根據(jù)預(yù)測(cè)靶基因功能推測(cè)sRNA參與細(xì)菌抗逆性和致病性等多種生理進(jìn)程[11]。本研究根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)酸性環(huán)境下差異表達(dá)的sR082進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在正常環(huán)境條件還是在酸性環(huán)境條件下，sR082都是在早期表達(dá)量最高，而在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期表達(dá)量逐漸下降；在pH 5的條件下，sR082在細(xì)菌生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期表達(dá)量均顯著增加，說(shuō)明sR082可能與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌耐受酸性環(huán)境脅迫的能力有關(guān)。為了進(jìn)一步探究sR082與細(xì)菌應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境關(guān)系，我們檢測(cè)了sR082敲除株和野生株在不同pH值情況下生長(zhǎng)情況。研究發(fā)現(xiàn)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌TXΔsR082在pH 6時(shí)生長(zhǎng)速度減緩；而在pH 5時(shí)，TXΔsR082的生長(zhǎng)速度顯著降低。這些結(jié)果表明sR082通過(guò)調(diào)控靶基因參與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌適應(yīng)吞噬細(xì)胞的酸性環(huán)境，抵抗吞噬細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)而在宿主吞噬細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)sR082可能在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌感染魚(yú)類(lèi)細(xì)胞和組織中發(fā)揮重要作用。

圖5 TXD1和TXΔsR082感染牙鲆的致死率

細(xì)菌sRNA能夠通過(guò)調(diào)控自身毒力基因表達(dá)，有效地促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖，從而有利于其在宿主體內(nèi)的侵染和存活。大腸桿菌sRNA Teg41通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)菌的毒力[20]；在金黃色葡萄球菌中，Teg49敲除株失去調(diào)控sarA基因表達(dá)的能力，從而降低對(duì)人類(lèi)皮膚的感染能力[21]。另外有研究報(bào)道sRNA能夠調(diào)控包括霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌在內(nèi)的多種人類(lèi)病原菌[22]，但是對(duì)于sRNA調(diào)控魚(yú)類(lèi)病原菌的毒力機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌sR082和哺乳動(dòng)物病原菌sRNA有相似的功能。通過(guò)比較TXΔsR082與TXD1對(duì)FG細(xì)胞的侵染，發(fā)現(xiàn)TXΔsR082侵染FG細(xì)胞能力顯著降低，同時(shí)在FG細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力降低，說(shuō)明sR082對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌感染細(xì)胞和胞內(nèi)存活能力有顯著影響。組織侵染結(jié)果表明，TXΔsR082侵染至牙鲆脾和腎組織中的數(shù)量均顯著降低，說(shuō)明sR082對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的體內(nèi)感染能力有顯著影響。致死率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TXΔsR082對(duì)于牙鲆的致死率降低。這些結(jié)果表明殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌sR082是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控毒力相關(guān)sRNA，能夠調(diào)控殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌適應(yīng)吞噬細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境，進(jìn)而發(fā)揮感染細(xì)胞、組織和魚(yú)體的能力。

綜上所述，在本研究中，我們通過(guò)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)，證明殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的sRNA sR082在細(xì)菌應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境壓力和致病性方面起著重要的作用。這些研究結(jié)果揭示了sRNA在細(xì)菌感染過(guò)程中的重要性，加深了對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的致病機(jī)制的理解。