倪 敏，王培珍，卜其濤，許世輝，董志穎*，張成中,*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中醫(yī)院,上海200120；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海200433；3.安徽省阜陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，阜陽(yáng)236015；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海200120）

三七花又稱田七花，為五加科植物三七（Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen ex C.Chow.）的干燥花序。《中藥大辭典》記載三七花具有清熱，平肝，降壓等功效?？捎糜谥委煾哐獕?，頭昏，目眩，耳鳴，急性咽喉炎等癥[1]。三七花是三七全株中含三七皂苷成分最高的部位，其含量可達(dá)10%以上，除三七皂苷外還含有其他多種皂苷，如人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3等，另外，還有多糖、黃酮、氨基酸、揮發(fā)油等多種活性成分及K、Na、Ca、Mg、Al、Cl、P、S、Fe、Zn、Cu、Si、Mn 和 Ni等微量元素[2～3]。其中，三七皂苷為三七花最主要的藥理活性成分[4]，具有擴(kuò)張血管[5]、修復(fù)血管[6]、修復(fù)皮膚創(chuàng)傷[7]、降血壓[8]、鎮(zhèn)痛、抗炎、止血和造血[9]等功能；人參皂苷作為三七花主要活性成分之一對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)都有一定的保護(hù)作用，在抗癌方面也有重要作用[10]。鑒于人參皂苷Rb2、Rb3活性明確易于獲得，故本實(shí)驗(yàn)以其為對(duì)照品。近年來，隨著國(guó)民收入的提高，人們對(duì)養(yǎng)生保健也越來越重視，三七花茶飲憑借其優(yōu)良的口感迅速發(fā)展，并遠(yuǎn)銷海外，成為了三七資源整合利用的重要組成部分[11]。三七花在醫(yī)藥、保健、食品飲料、化妝品等方面具有廣泛應(yīng)用，但查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)三七花質(zhì)量控制的研究多集中于性狀鑒別、理化鑒別等方面，且僅簡(jiǎn)單收載于上海、重慶、四川等地市的地方標(biāo)準(zhǔn)中，《中華人民共和國(guó)藥典》（下稱 《中國(guó)藥典》）中還未能收載三七花的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。恰逢三七花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為新版安徽省中藥飲片炮制規(guī)范編修的立項(xiàng)要求之一，故開展本次實(shí)驗(yàn)研究為三七花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的借鑒。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

本實(shí)驗(yàn)收集到產(chǎn)自廣西、云南等地共10批三七花藥材，批號(hào)見表1，經(jīng)阜陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心主任藥師許世輝鑒定為五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen ex C.Chow.）的干燥花。人參皂苷Rb2（批號(hào)：111715-201203，純度：93.8%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb3（批號(hào)：111686-201504，純度：97.0%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

LEICA DM500型雙目顯微鏡（德國(guó)laica公司）；E100H型超聲波清洗儀（德國(guó)Elma公司）；梅特勒-托利多分析天平 （METTLER TOLEDO公司）；SYZD型多功能振蕩器 （山東申儀電子科技有限公司）；SYLD-1型電子調(diào)溫電爐（山東申儀電子科技有限公司）；SX2-2.5-10型高溫箱型電爐 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；GZX-9023 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；LC-20系列島津液相色譜儀（島津株式會(huì)社）；超聲波提取儀 （上海精密儀器儀表有限公司）；FST-Ⅲ-2.0普利菲爾超純水機(jī) （上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）；數(shù)碼照相機(jī)（日本佳能公司）；半自動(dòng)薄層點(diǎn)樣及成像儀（瑞士CAMAG有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝

三七花以花類藥材入藥，采收花序干燥或陰干，以凈制法為主[12]。故具體方法擬定為取原藥材，除去泥沙、莖葉等雜質(zhì)，干燥。

2.2 性狀鑒別

呈不規(guī)則半球形、球形或傘形，直徑約0.5～2.5cm；有花80～100朵；放大鏡下觀察，花梗被微絨毛；小花梗細(xì)短，基部具有鱗片狀苞片；花萼綠色，先端通常5齒裂；花瓣5，黃綠色。質(zhì)輕。氣微，味甘、微苦[13]。

2.3 顯微粉末鑒別

三七花粉碎過篩。本品粉末黃綠色。導(dǎo)管易見，多為螺紋導(dǎo)管或環(huán)紋導(dǎo)管；花粉粒眾多，圓形或類圓形，可見2～3個(gè)萌發(fā)孔；氣孔不等式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)；樹脂道碎片含黃色分泌物。詳見圖1～4。

圖1 導(dǎo)管Fig.1 Catheter

圖2 花粉粒Fig.2 Microspore

圖3 不等式氣孔Fig.3 Inequality stomata

圖4 樹脂道碎片及分泌物Fig.4 Resin fragments and secretions

2.4 薄層鑒別[14]

取本品藥材粉末0.5g，加水約10mL，攪勻，再加以水飽和的正丁醇10mL，密塞，振搖約10min，放置2h，離心，取上清液，加3倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層（必要時(shí)離心），取正丁醇層，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb3對(duì)照品，用甲醇制成每1mL含1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液1μL，對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4:1:5）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖5；置紫色外光燈（365nm）下檢視，顯相同的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖6。

圖5 供試品薄層色譜Fig.5 TLC for Test sample

圖6 供試品薄層色譜（紫外燈365nm波長(zhǎng)下）Fig.6 TLC for Test sample(Under UV light,λ=365nm)

(從左到右依次為 1.SQH-1-001、2.SQH-1-002、3.SQH-1-003、4. 人參 皂 苷 Rb3、5.SQH-1-004、6.SQH-1-005、7.SQH-1-006、8.SQH-1-007、9.人參皂苷Rb3、10.SQH-1-008、11.SQH-1-009、12.SQH-1-010 From left to right：1.SQH-1-001、2.SQH-1-002、3.SQH-1-003、4.ginsenosideRb3、5.SQH-1-004、6.SQH-1-005、7.SQH-1-006、8.SQH-1-007、9.ginsenoside Rb3、10.SQH-1-008、11.SQH-1-009、12.SQH-1-010)

2.5 水分測(cè)定

參照 《中國(guó)藥典》2015年版四部0832水分測(cè)定法第二法共測(cè)定10批次三七花的水分。結(jié)果見表1。

表1 含水量測(cè)定Table 1 Moisture content text

從以上結(jié)果可知三七花飲片的水分在10.27%～14.07%之間。應(yīng)以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析測(cè)試數(shù)據(jù),基于測(cè)試數(shù)據(jù),設(shè)定水分限度的公式如下：

注：是樣本的平均數(shù)；t是置信水平為99%的學(xué)生t檢測(cè)值 (單尾)；s是樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n是樣本的批數(shù)；MU是不確定度評(píng)估。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，擬定水分限度應(yīng)不得過15.0%。

2.6 總灰分和酸不溶灰分測(cè)定

2.6.1 總灰分測(cè)定 參照 《中國(guó)藥典》2015年版四部2302灰分測(cè)定法共測(cè)定10批次三七花飲片總灰分。結(jié)果見表2。

表2 總灰分測(cè)定Table 2 Total ash content text

從以上結(jié)果可知10批三七花飲片的總灰分在5.37%～7.40%之間。應(yīng)以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析測(cè)試數(shù)據(jù),基于測(cè)試數(shù)據(jù),設(shè)定總灰分限度的公式如下：

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，擬定總灰分限度應(yīng)不得過7.0%。

2.6.2 酸不溶灰分測(cè)定

共測(cè)定10批次三七花飲片的酸不溶性灰分，其平均值為0.09%，擬定不列入限度要求。酸不溶性灰分主要考察泥沙污染，而三七花為地上部分，且10批三七花酸不溶性灰分結(jié)果都很低，說明污染不明顯，所以只規(guī)定總灰分，酸不溶性灰分不做限度要求。

2.7 浸出物測(cè)定

用水作溶劑，照水溶性浸出物熱浸法測(cè)定，共測(cè)定10批次三七花飲片浸出物（具體方法參照《中國(guó)藥典》2015年版四部2201浸出物測(cè)定法)。結(jié)果見表3。

表3 水浸出物含量實(shí)驗(yàn)Table 3 Water extract content text

從以上結(jié)果可知10批三七花飲片的浸出物在53.47%～63.29%之間。應(yīng)以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析測(cè)試數(shù)據(jù),基于測(cè)試數(shù)據(jù),設(shè)定浸出物限度的公式如下：

擬定照水溶性浸出物測(cè)定法 （參照 《中國(guó)藥典》2015年版四部2201)測(cè)定，用水作溶劑，浸出物不得少于49.0%。

2.8 含量測(cè)定

照高效液相色譜法 （《中國(guó)藥典》2015年版四部0512）測(cè)定。

2.8.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（32:68)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，理論板數(shù)按人參皂苷Rb3峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.8.2 對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL約含20μg的溶液，即得。

2.8.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過2號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理（功率240W，頻率45kHz)60min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.8.4 線性范圍考察

精密稱取純度為93.8%的人參皂苷Rb2對(duì)照品10.75mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，分別精密量取一定量的的對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為 0.0403、0.0807、0.1008、0.1210、0.1613、0.2017 mg·mL-1的對(duì)照品溶液；精密稱取純度為97.0%人參皂苷Rb3對(duì)照品19.80mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，分別精密量取一定量的的對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為0.0768、0.1536、0.1921、0.2305、0.3073、0.3841mg·mL-1的 對(duì) 照 品 溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，以濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線f(x)=2,291,845.94351 x-478.50000 (r=0.99994)及f(x)=2,328,302.59251 x+2,319.57143(r=0.99992)。

2.8.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取SQH-01-010樣品約0.25g，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理（功率240W，頻率45kHz)60min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，測(cè)定含量，平行取樣測(cè)定5次，計(jì)算每次人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3的含量及RSD%，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 4 Repeated text(n=5)

2.8.6 精密度試驗(yàn)

精密稱取人參皂苷Rb2對(duì)照品10.75 mg、人參皂苷Rb3對(duì)照品19.80mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲使溶解，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，平行測(cè)定5次，計(jì)算RSD%，結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗(yàn)(n=6)Table 5 Precision text(n=6)

2.8.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品SQH-01-001適量，按供試品溶液的制備項(xiàng)下，同法制備樣品溶液，分別在 0、4、8、12、24h 等，分別進(jìn)樣，測(cè)定人參皂苷Rb2、Rb3的含量并計(jì)算RSD%值，結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=2)Table 6 Stability text(n=2)

2.8.8 加樣回收率試驗(yàn)

取SQH-01-001樣品約0.12g，精密稱定，精密加入含人參皂苷Rb2、Rb3的對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法處理，得相關(guān)溶液，進(jìn)液相色譜儀處理，計(jì)算含量及加樣回收率，結(jié)果見表7。

表7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 7 Recovery rate text(n=6)

2.8.9 樣品測(cè)定

測(cè)定10批樣品結(jié)果見表8，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算，參照《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)原則，擬定含量限度為：按干燥品計(jì)算本品含人參皂苷Rb2不得少于1.0%、人參皂苷Rb3不得少于3.0%。

表8 含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)（n=10＊2）Table 8.Content determination text(n=10*2)

3 討論

3.1 方法學(xué)考察

提取條件的選擇：溶劑選取甲醇，分別測(cè)定不同料液比及不同提取時(shí)間提取的含量，結(jié)果顯示，當(dāng)料液比相同時(shí)，提取60min較30min的提取率更高，故選擇稱取0.25g，用甲醇定容至50mL，超聲60min為提取條件。

3.2 薄層鑒別

三七花是三七全株中含人參皂苷最多的部位，且以Rb族為主[15]。鑒于三七花中的有效成分人參皂苷Rb3活性明確，單體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易于獲得符合法定標(biāo)準(zhǔn)的成品，在三七各部位中僅在三七花和三七莖中存在[16]。且人參皂苷Rb3在易混藥材人參花中含量極低，可作為特征化合物用于鑒別人參花與三七花[17]，故本實(shí)驗(yàn)以其作為對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別。

3.3 含量測(cè)定

含量測(cè)定在藥材質(zhì)量控制中是最為重要的一部分，根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果可以判斷該藥材是否經(jīng)歷了規(guī)范的制備流程，淘汰有效成分含量過低的藥材，從而保證藥材質(zhì)量，保證療效。本次實(shí)驗(yàn)中尚存在一些不足，在加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，理論要求加樣回收率在92%～105%，RSD＜5%，但實(shí)測(cè)結(jié)果差中Rb2的平均回收率為106.7%，Rb3的平均回收率為106.3%，RSD為2.3%，與理論要求存在一定差異。在樣品測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，部分批次樣品數(shù)據(jù)相對(duì)偏差大于2%。故在日后在對(duì)三七花有效成分含量測(cè)定的研究中，還需對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步優(yōu)化，從而建立更加完備的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，性狀特征，顯微特征鑒別定、波層色譜法鑒別等實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)θ呋ㄟM(jìn)行真?zhèn)舞b定，水分、灰分等檢查以及浸出物測(cè)定等能夠控制三七花的優(yōu)劣。含量測(cè)定以人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定分別應(yīng)不得少于1.0%和3.0%，但方法學(xué)考察稍有偏離標(biāo)準(zhǔn)要求，需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究符合國(guó)家有關(guān)中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定要求，能夠?qū)θ呋ǖ馁|(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。