周家明 ，張學(xué)美 ，馬 妮 ，趙 愛(ài)，馮光泉 *

（1.文山學(xué)院三七研究院，文山663099；2.文山學(xué)院三七學(xué)院，文山663099）

三七是中國(guó)特有的名貴中藥材，它不僅具有很好的藥用價(jià)值，而且還有很好的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和研究?jī)r(jià)值，以三七為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品越來(lái)越多。目前人們研究的精華液大多數(shù)是美白祛斑的，如侯偉等[1]研究改善黃褐斑的精華液；李圓圓等[2]研究抗氧化美白的精華液；楊小燕[3]研究祛痘精華液。市場(chǎng)上常見(jiàn)與三七有關(guān)的化妝品主要有三七乳液、三七早霜、三七晚霜、三七面膜、三七粉底液、三七洗面奶等，很少見(jiàn)到三七精華液。所以我們將研發(fā)以三七為主要原料的祛痘抗炎精華液，具有廣闊的市場(chǎng)前景?；瘖y品市場(chǎng)上琳瑯滿目，有洗面奶、水乳、面霜、精華等，而精華是高濃度濃縮的，能讓皮膚更好的吸收。精華液常見(jiàn)的都是保濕、美白、抗衰老的，現(xiàn)代生活節(jié)奏快，大多數(shù)人都會(huì)長(zhǎng)痘，市場(chǎng)上很少見(jiàn)到以三七為主的抗炎祛痘精華液。為了填補(bǔ)這一研發(fā)與市場(chǎng)的空白，我們將對(duì)三七抗炎祛痘精華液進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)，從而改善人們長(zhǎng)痘的皮膚，解決因此而帶來(lái)的煩惱。臉上長(zhǎng)痘既與內(nèi)在因素有關(guān)也與外在因素有關(guān)，臉上長(zhǎng)痘是由體內(nèi)某種毒素引起的，長(zhǎng)痘也與情緒、壓力、生活不規(guī)律等外在因素有關(guān)，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，表現(xiàn)為臉上不停地長(zhǎng)痘。為了解決祛痘這個(gè)問(wèn)題，人們都會(huì)選擇中藥內(nèi)服外用一起調(diào)理。因?yàn)橹兴帉儆谔烊坏?，毒副作用小，有的甚至沒(méi)有毒副作用，并且功效持久穩(wěn)定，而中藥抗炎祛痘化妝品就是最好的選擇。因此我們選擇研發(fā)以中藥為主的三七精華液，希望能幫解決人們長(zhǎng)痘的困擾，也為后期研究者提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋、熱回流裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱鼓風(fēng)干燥箱、循環(huán)水式真空泵、pH酸度計(jì)、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、電子天平、超聲清洗機(jī)、紫外分光光度計(jì)。

1.2 材料與試劑

三七購(gòu)于文山三七市場(chǎng)，黃芩、苦參原藥材采購(gòu)于文山百信藥店，粉碎過(guò)10目篩備用；培養(yǎng)皿、容量瓶、移液管、三七皂苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、苦生堿對(duì)照品；蒸餾水、無(wú)水乙醇、甲醇、三氯甲烷、濃硫酸。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 工藝優(yōu)化

通過(guò)查閱資料可知，藥材提取工藝研究一般采用正交試驗(yàn)法。藥材配比、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度、提取溶劑作為提取工藝中的重要因素，改變?nèi)魏我粋€(gè)比例都會(huì)影響提取率。參照三七皂苷、黃芩苷、苦參堿提取工藝研究的[4～9]相關(guān)文獻(xiàn)和祛痘中藥的提取工藝研究的相關(guān)文獻(xiàn)[10～12]，本試驗(yàn)也采用提取溶劑為70%的乙醇，提取溫度為80℃，料液比為1:8，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為2h，以藥材配比為提取工藝的的關(guān)鍵因素，進(jìn)行提取。根據(jù)藥材配方正交設(shè)計(jì)表2-1稱取9份藥材進(jìn)行提取，提取之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮到35mL，放到冰箱中備用。然后以pH值和和抑菌效果作為藥材配方的評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出一組最佳的藥材配方，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表2 -1藥材配方正交試驗(yàn)因素和水平

2.1.1 pH值測(cè)定

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》樣品pH值測(cè)定采用的是直接法測(cè)定法，首先用蒸餾水洗滌玻璃電極，用濾紙吸干后，將需要測(cè)定的樣品放入到燒杯中，直接把電極插入到樣品中，待酸度計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定后，就從儀器上讀取兩次pH值，最后取兩次讀數(shù)后的平均值。

2.1.2 抑菌效果測(cè)定

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》化妝品菌落總數(shù)測(cè)定方法是先用滅菌吸管將10mL的樣品加到90mL滅菌生理鹽水中，制成1:10的檢液。用移液管吸取的檢液1mL，加入到滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將滅菌過(guò)的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，使培養(yǎng)基剛好蓋住培養(yǎng)皿底部，檢液與培養(yǎng)基充分混合均勻。待瓊脂凝固后，倒置培養(yǎng)皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后用肉眼觀察，數(shù)菌落數(shù)，記下各培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。經(jīng)過(guò)測(cè)定pH值跟菌落數(shù)后從正交試驗(yàn)9組中確定最佳的pH值接近人體的且有抑菌效果的一組藥材配方。

確定藥材配方后，采用挖孔法檢測(cè)抑菌效果。將加有氯化三苯四氮唑的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中凝固后,打2個(gè)直徑16mm的孔,做好標(biāo)記。用鑷子取出孔中的瓊脂。用移液槍分別移取150μL的提取液和稀釋10倍后的提取液加入到挖好的孔中。放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈直徑。重復(fù)試驗(yàn)兩次[13～15]。

2.2 脫色試驗(yàn)

提取液濃縮出來(lái)顏色比較深，會(huì)直接影響后期的含量測(cè)定，所以需要進(jìn)行脫色。實(shí)驗(yàn)室常用的脫色方法有活性炭脫色法和雙氧水脫色法。活性炭屬于物理脫色，是吸附脫色，將藥材中的色素脫掉。而雙氧水是強(qiáng)氧化性的物質(zhì)，將色素氧化而達(dá)到脫色的目的。通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知活性炭用量為1%，取100mL提取液加入1%活性炭和4%的雙氧水然后進(jìn)行脫色，對(duì)比脫色效果。在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中雙氧水的限用量為4%,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置雙氧水的濃度梯度為1%、2%、4%，探究雙氧水的最佳脫色條件。將樣品脫色后進(jìn)行干燥，便于后期樣品的含量測(cè)定。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 三七皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取三七總皂苷對(duì)照品10.2mg，加甲醇稀釋至100mL刻度，制成三七總皂苷對(duì)照品溶液。用移液管分別吸取 0、1、2、3、4、5mL 分別置于 10mL 容量瓶中，揮干溶劑，加入濃硫酸1mL，在80℃的恒溫水浴中加熱反應(yīng) 1h后，立即置于冰水中冷卻5min，再分別加無(wú)水乙醇稀釋至 10mL刻度，搖勻,放置30min，以試劑作空白對(duì)照，在277nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度[16]。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=0.7647x+0.0434（r2=0.9993）。

2.3.2 樣品的制備

稱取3份的藥材同時(shí)進(jìn)行提取濃縮干燥成粉末，分別精密稱取三份干燥的樣品粉末各0.2g，分別加甲醇稀釋至50mL刻度。用移液管吸取1mL置于10mL容量瓶中，以0mL樣品溶液作空白對(duì)照，按照2.3.1的方法測(cè)定吸光度。

2.3.3 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品10mg，加無(wú)水乙醇定容至100mL刻度，制成黃芩苷對(duì)照品溶液。用移液管分別吸取 2、4、6、8、10mL 分別置于 50mL 的容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容刻度，搖勻，放置10min，以乙醇溶液作空白對(duì)照，在278nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度[17]。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.05x+0.0062（r2=0.9977）。

2.3.4 樣品的制備

稱取3份的藥材同時(shí)進(jìn)行提取濃縮干燥成粉末，分別精密稱取3份干燥的樣品粉末各0.2g，分別加無(wú)水乙醇定容至50mL刻度。稀釋40倍后，分別加無(wú)水乙醇定容至50mL刻度。以乙醇溶液作空白對(duì)照，搖勻，放置 10min，在278nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

2.3.5 苦生堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取苦參堿對(duì)照品10mg，加無(wú)水乙醇定容至50mL刻度，制成苦生堿對(duì)照品溶液。用移液槍分別吸取 0、100、150、200、250、300μL 分別置于 25mL具塞試管中。在85℃水浴中蒸干溶液后，加入溴麝香草酚藍(lán)磷酸氫二鈉緩沖溶液6mL，再精密加入三氯甲烷6mL，密塞劇烈振搖2min，放置 30 min，使水層和三氯甲烷層完全分層后[18]，棄去上清液，以0mL作空白對(duì)照，在416nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 y=244.5x+0.0088（r2=0.9996）。

2.3.6 樣品的制備

稱取3份的藥材同時(shí)進(jìn)行提取濃縮干燥成粉末，分別精密稱取3份干燥的樣品粉末各0.2g，分別加無(wú)水乙醇定容至50mL刻度。稀釋2倍后，分別加無(wú)水乙醇定容至50mL刻度。用移液槍吸取0.5mL置于25mL具塞試管中，以0mL樣品溶液作空白對(duì)照，按照2.3.1的方法測(cè)定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)正交試驗(yàn)，共得到9組數(shù)據(jù)，提取出的9組樣品根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》測(cè)定pH值和抑菌效果，重復(fù)試驗(yàn)兩次，結(jié)果見(jiàn)表3-1。

表3 -1藥材配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由于人體皮膚的pH值范圍在4.5～6.5之間，從pH值的測(cè)定結(jié)果看，測(cè)出的9組pH值都在范圍內(nèi)，適用于人體。pH值不能作為主要指標(biāo)，只能作為參考指標(biāo)，而把菌落數(shù)作為主要指標(biāo)。根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平結(jié)果表3-1可知，藥材配方的因素主次順序?yàn)椋築＞A＞C，三七＞黃芩＞苦參，黃芩的影響最大。最優(yōu)的組合為 A3B3C3，即三七 30g、黃芩 30g、苦參 20g。 結(jié)果見(jiàn)表3-2。

表3 -2抑菌結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該中藥配方有一定的抑菌效果

3.2 脫色試驗(yàn)結(jié)果

由于提取濃縮出來(lái)的藥材溶液顏色比較深，會(huì)影響后期的含量測(cè)定，所以需要脫色。以下是提取液在60℃溫水浴中加熱，且在雙氧水的濃度梯度為1%、2%、4%中的變化,與提取液對(duì)比。

表3 -3在雙氧水中脫色比較

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，從表3-3中可以看出濃度為2%的雙氧水脫色效果比1%和4%的脫色效果好，并且雙氧水脫色效果最好的時(shí)間段為10～15min，也在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的限用量范圍內(nèi)。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果

3.3.1 三七皂苷的測(cè)定結(jié)果

三七皂苷含量%=7.7%，根據(jù)《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，三七皂苷的含量不得少于5.0%，樣品的三七皂苷含量是7.7%，已經(jīng)達(dá)到了規(guī)定。

3.3.2 黃芩苷的測(cè)定結(jié)果

黃芩苷含量%=9.3%，根據(jù) 《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，黃芩苷的含量不得少于9.0%，樣品的黃芩苷含量是9.3%，已經(jīng)達(dá)到了規(guī)定。

3.3.3 苦生堿的測(cè)定結(jié)果

苦生堿含量%=1.3%，根據(jù) 《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，苦參堿的含量不得少于1.2%，樣品的苦參堿含量是1.3%，已經(jīng)達(dá)到了規(guī)定。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了藥材的最佳配方為三七:黃芩:苦參=3:3:2，同時(shí)測(cè)定得到樣品中三七皂苷、黃芩苷和苦參堿的含量分別為7.7%、9.3%和1.3%。根據(jù)2015版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，三七皂苷的含量不得少于5.0%，黃芩苷的含量不得少于9.0%，苦參堿的含量不得少于1.2%。 所測(cè)含量都高于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的含量。配方中三七皂苷、苦生堿和黃芩苷的含量達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)中的配方表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，具有潛在的抗炎效果。三七、黃芩、苦參有很多藥理作用，但其中起抗炎作用的是三七總皂苷、黃芩苷和苦參堿。因此選擇檢測(cè)樣品中的三七總皂苷、黃芩苷和苦參堿的含量。因?yàn)檠芯块_(kāi)發(fā)的三七精華液適用于人體，所以產(chǎn)品的pH值就必須在人臉的pH值范圍內(nèi)，并且研究開(kāi)發(fā)的是抗炎祛痘的三七精華液，所以需要有抑菌抗炎的效果，為了證明產(chǎn)品有抑菌抗炎效果且適用于人體，所以選用數(shù)菌落數(shù)和pH值測(cè)定作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。