堯戰(zhàn)勇 張亮 許春娣 傅睿,4（通訊作者）

（1 南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院 江西 南昌 330006）

（2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院兒內(nèi)科 上海 201801）

（3 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院兒內(nèi)科 上海 200025）

（4 江西省兒童醫(yī)院腎內(nèi)科 江西 南昌 330006）

現(xiàn)知全世界約一半人群感染了幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)，且我國也有42%～90%高感染率[1]。研究已證明，Hp 作為致病因子，不僅與胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤乃至胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，還是引起包括心腦血管、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肝膽、皮膚、營養(yǎng)代謝及自身免疫病等胃腸道以外疾病的重要因素[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的，直徑為30 ～150nm，電鏡下呈球狀或杯狀，來源于細(xì)胞內(nèi)吞途徑中的多泡小體。外泌體富含母細(xì)胞成分，通過傳遞蛋白質(zhì)、脂類和核苷酸在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。在正常和病理狀態(tài)下，外泌體廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等體液中[3]。我們提取Hp 感染患兒血清外泌體，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體中的蛋白組分，為Hp 感染作為致病因子所致相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制的研究提供思路。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本來源及分組 選取2017 年2 月—2018 年2 月因反復(fù)惡心嘔吐、反酸、噯氣、腹脹、上腹部疼痛等上消化道癥狀來上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院及瑞金北院兒內(nèi)科就診的慢性胃炎患兒，隨機(jī)選取3 例確診為Hp 感染兒童，同期選取3 例健康體檢兒童，分別設(shè)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，年齡（6 ～37）歲，均經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情同意并簽訂知情同意書。實(shí)驗(yàn)經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

幽門螺桿菌感染陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)具備以下兩點(diǎn)：①胃黏膜組織病理學(xué)檢查和快速尿素酶試驗(yàn)陽性；②13C 尿素呼氣試驗(yàn)。

1.1.2 外泌體提取 應(yīng)用美國101Bio 的試劑盒PureExo? Exosome Isolation Kit(for serum or plasma)從血清中提取外泌體，經(jīng)電鏡和粒徑分析，獲得直徑為30 ～150nm 的小囊泡，證明提取的外泌體合格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白提取和還原烷基化處理 每個(gè)樣品取適量進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)；向其中加入蛋白裂解液，混勻后冰上孵育5min，加入終濃度10mM 的DTT，冰浴超聲15min，然后13000g，4℃離心20min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中；向離心管中加入4 倍體積的冷丙酮，在-20℃靜置過夜。離心收集蛋白沉淀，空氣中晾干。加入8M urea/100mM TEAB(pH8.0)溶液重新溶解蛋白，加入DTT至終濃度10mM，56℃水浴30min 進(jìn)行還原反應(yīng)。隨后加入IAM 至終濃度55mM，暗處室溫放置30min 進(jìn)行烷基化反應(yīng)。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 酶解和除鹽 將來自每個(gè)樣品的等量的蛋白質(zhì)用于胰蛋白酶消化。取100μg 的蛋白質(zhì)用于胰蛋白酶消化。用100mM TEAB 將蛋白溶液稀釋5 倍后，按1：50 的質(zhì)量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜。酶解后的肽段用C18 柱脫鹽，真空冷凍干燥脫鹽后的肽段。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用的是TripleTOF 5600 +液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（SCIEX）。將多肽樣品溶解于2%乙腈/0.1%甲酸中，并使用與Eksigent nanoLC 系統(tǒng)（SCIEX，USA）偶聯(lián)的TripleTOF 5600plus 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。將多肽溶液加到C18 捕獲柱（5μm，100μm×20mm）上，并以120min 時(shí)間梯度，300nL/min 的流速在C18 分析柱（3μm，75μm×150mm）上進(jìn)行梯度洗脫。 兩個(gè)流動(dòng)相是緩沖液A（2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O）和緩沖液B（98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O）。對(duì)于IDA（信息依賴性采集），以250ms的離子累積時(shí)間進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖的掃描，并以50ms 的離子累積時(shí)間采集40 個(gè)前體離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。在350 ～1500m/z 的范圍內(nèi)采集MS1 光譜，并且在100 ～1500m/z的范圍內(nèi)采集MS2 光譜。將前體離子動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為15s。

1.3 信息分析流程

1.3.1 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù) 選用swiss-prot 數(shù)據(jù)庫的Homo sapiens 序列+污染庫序列，共包含20213 條蛋白序列。

1.3.2 蛋白質(zhì)的鑒定及定量 鑒定結(jié)果的過濾標(biāo)準(zhǔn)為肽段可信度＞=95%，鑒定的蛋白至少包含一個(gè)獨(dú)特的肽段。通過Skyline 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，對(duì)檢測(cè)到的190 個(gè)蛋白進(jìn)行定量分析，共39 個(gè)差異蛋白。

1.3.3 差異蛋白功能分析 采用STRING 軟件中functional protein association networks 進(jìn)行生物功能和疾病分析。

2.結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組3 例患兒均為上消化道內(nèi)鏡病理檢查和13C 呼氣試驗(yàn)雙陽性確診。對(duì)照組3 例健康體檢兒童均為血清Hp 抗體及13C呼氣試驗(yàn)陰性。

2.2 血清來源的外泌體的鑒定

微泡直徑大小在30 ～150nm 之間，呈杯狀凹陷，與公認(rèn)的外泌體形態(tài)一致。

2.3 血清來源的外泌體的蛋白組分分析

在外泌體蛋白中，有190 個(gè)蛋白是與數(shù)據(jù)庫重合的，其中39 個(gè)蛋白是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異蛋白，其中上調(diào)蛋白19 個(gè)，下調(diào)蛋白數(shù)20 個(gè)，其中P最小最顯著差異的蛋白、結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，對(duì)氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纖維連接蛋白(Fibronectin1,FN1)（表1）。顯著差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為，差異倍數(shù)|FC|≥1.5，P＜0.05。

表1 血清來源外泌體所含的差異蛋白比值P 最小前10 個(gè)蛋白

2.4 血清外泌體的功能分析

血清來源的外泌體蛋白參與疾病和功能過程，其中參與對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)、蛋白水解調(diào)節(jié)、內(nèi)吞作用、防御反應(yīng)等的功能蛋白在Hp 感染患兒血清外泌體中表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(圖1)。

圖1 Hp 患兒血清來源的外泌體所含蛋白相關(guān)的前10 個(gè)功能

3.討論

絕大部分成人Hp 感染是發(fā)生在兒童年幼階段，Hp 感染后在胃黏膜上皮細(xì)胞定植，通過中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)胃黏膜浸潤(rùn)，這種免疫和炎癥反應(yīng)自身難以清除[4]，使宿主容易出現(xiàn)慢性炎癥[5]引起并發(fā)癥，并持續(xù)到成年后期。Hp 感染可能通過改變血脂、增強(qiáng)LDL 氧化、激活炎癥反應(yīng)參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[6]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，抗幽門螺桿菌IgG 陽性與動(dòng)脈粥樣硬化和小動(dòng)脈疾病引起的缺血性中風(fēng)(IS)風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，尤其是對(duì)于非心源性栓塞性IS[7]。臺(tái)灣學(xué)者對(duì)臺(tái)灣民眾健康保險(xiǎn)研究資料庫的大數(shù)據(jù)分析提示根除H p 與冠心病呈正相關(guān)[8]。有學(xué)者利用已發(fā)表的前瞻性隊(duì)列研究確定H p 和冠心病之間的關(guān)系，在19 項(xiàng)隊(duì)列研究中的13 項(xiàng)研究中觀察到Hp 慢性感染對(duì)主要冠心病事件的風(fēng)險(xiǎn)影響增加[9]。Hp 感染是否為心血管疾病危險(xiǎn)因素一直存在爭(zhēng)議，Hp 感染后如何致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

近年來，對(duì)于外泌體的相關(guān)研究倍受關(guān)注，外泌體不僅在調(diào)控正常生理過程如組織修復(fù)、維持干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、免疫監(jiān)視和血液凝固等中發(fā)揮重要作用，而且參與許多疾病的病理生理過程。通過對(duì)H p 患兒及對(duì)照組血清來源的外泌體質(zhì)譜分析共檢測(cè)到190 個(gè)蛋白，有顯著差異蛋白39 個(gè)，P最小最有顯著差異的蛋白為對(duì)氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纖維連接蛋白(Fibronectin1,FN1)、結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，其中PON1 為下調(diào)蛋白，我們將其列為研究對(duì)象之一。PON1 能夠水解多種有機(jī)磷底物和內(nèi)酯，以及多種芳香羧酸酯，介導(dǎo)低密度脂蛋白酶的保護(hù)作用，防止氧化修飾和由此引起的一系列導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成，參與HDL的抗氧化功能，具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用，推測(cè)P O N1 在預(yù)防細(xì)菌感染中的作用可能與HDLs 在先天免疫中的作用有關(guān)[10]。第一篇報(bào)道Hp 感染患者的對(duì)氧化酶和芳香酯酶活性的論文實(shí)驗(yàn)觀察到Hp 感染陽性組HDL-c 水平顯著低于Hp 感染陰性組，而LDL-c 水平顯著高于陰性組[11]。Hp 可誘導(dǎo)長(zhǎng)期存在的低級(jí)別持續(xù)性炎癥刺激[5]，PON1 活性可能在炎癥過程中降低[12]。血清PON1 活性降低可能與HDL-C 的降低有關(guān)，部分與H p 感染引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[11]。在一項(xiàng)前瞻性的臨床研究中表明，PON1 活性的降低是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]。本研究首次發(fā)現(xiàn)在H p 感染的患兒血清外泌體中下調(diào)蛋白PON1，Hp 感染后通過什么因子調(diào)控PO N1 對(duì)降低動(dòng)脈粥樣硬化以及保護(hù)心臟的確切機(jī)制仍有待詳細(xì)闡明，然而我們的這項(xiàng)研究有一些潛在的局限性，樣本量很小，所以需要在更大的人群中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究對(duì)比Hp 感染與健康兒童血清外泌體蛋白表達(dá)差異，提示Hp 感染可能通過刺激機(jī)體慢性持續(xù)低度炎癥反應(yīng)，改變炎癥細(xì)胞外泌體組成成分（如PO N1），影響機(jī)體健康狀況，如心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，具體靶點(diǎn)細(xì)胞及相關(guān)信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。