樊桂靈，周翔宇，錢葉遷，李玉鋒

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

蛹蟲草，也稱為北蟲草、北冬蟲夏草，是一種藥食兼用的大型蟲生真菌，一般由活體蟲蛹培養(yǎng)[1]。蛹蟲草中含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等多種化學成分[2]，它和冬蟲夏草的主要成分相差不多。其中蟲草素又稱蛹蟲草菌素，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素[3]。蟲草素參與人體細胞代謝的多個過程，具有抗菌、抗白血病、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血再灌注損傷及清除體內(nèi)自由基等多方面藥理作用[4]。蟲草多糖是蛹蟲草中含量較高的活性物質(zhì)之一，它是一種良好的免疫促進物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強免疫[5]、調(diào)節(jié)血糖[6]等功效。此外，蟲草多糖也對補肺腎、益精氣有明顯功效，已應用于醫(yī)藥與保健食品的生產(chǎn)與研究[7]。蛹蟲草對人的肺陰和腎陽都具有很好的滋補作用，在平衡、調(diào)節(jié)陰陽的效果上起著重要的作用，是上等的滋補佳品[8]，具有很好的研究開發(fā)前景。

泡騰片屬于片劑中的一種特殊劑型，質(zhì)量穩(wěn)定，服用方便，起效迅速；它的口感也比較好，對于兒童、老人以及不喜歡服藥的患者來說很適用，再加上泡騰片攜帶方便，所以極易受到廣大患者的歡迎[9]。近年來泡騰片在食品和保健品領域被廣泛研究利用，成果顯著，如黑莓泡騰片[10]、維生素C泡騰片[11]等。

隨著生活水平的提高，天然的保健食品更受人們的青睞。蛹蟲草作為一種既可食用又可藥用的保健型真菌，正逐漸走入市場，其食用方法大多數(shù)是泡茶、煮水、泡酒、燉肉等；在劑型上，目前的研究還停留在膠囊[12]、口服液[13]、湯劑等傳統(tǒng)劑型，但是幾乎沒有將蛹蟲草提取物制備成攜帶方便、起效迅速的泡騰片劑型的報道。而蛹蟲草提取物泡騰片既能保留蛹蟲草自身具備的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功效，又能更好地利用泡騰片服用方便、生物利用度高等優(yōu)點，同時可使食用菌的價值得到充分利用，具有廣闊的發(fā)展前景[14]。因此本試驗根據(jù)蛹蟲草有效成分的理化性質(zhì)，對蛹蟲草活性成分進行提取，然后在前期單因素試驗基礎上利用正交試驗優(yōu)化原輔料配比，制備蛹蟲草提取物泡騰片，以期為蛹蟲草保健品開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草：南江宏信生物科技有限公司；檸檬酸：武漢銀飛化工有限公司；碳酸氫鈉：湖南裕華化工有限公司；乳糖：鄭州百思特食品添加劑有限公司；阿斯巴甜：安徽遠征生物工程有限公司；聚乙二醇6000：鄭州仁恒化工產(chǎn)品有限公司；葡萄糖：山東銳晟化工有限公司；蟲草素：成都普菲德生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZF-6021型真空干燥箱、BPG-9070A型精密鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；BDW1-FW-200型萬能粉碎機：西化儀（北京）科技有限公司；AL104型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器、RE-52AA型pH計：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市子華儀器有限責任公司；FD-1B-80型真空冷凍干燥機：南京覃思科技有限公司；TDP-1.5型單沖壓片機：上海歐壩機電有限公司；YD-20KZ型片劑硬度儀：北京中惠天城科技有限公司；FT-2000SE型脆碎度檢測儀：天津市天大天發(fā)科技有限公司；UV-2600紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草提取物的制備

將蛹蟲草子實體在60℃真空干燥箱中放置24 h，然后取出，將樣品粉碎，過60目篩，過篩后的蛹蟲草粉末裝在干燥后的玻璃容器中保存。稱取適量的蛹蟲草粉末于圓底燒瓶中，加入10倍量的蒸餾水，然后置于沸水浴中熱回流提取3次，每次90 min，抽濾，合并濾液。將濾液旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮液冷凍干燥后粉碎、過100目篩，制成蛹蟲草提取物凍干粉。

1.3.2 泡騰片的常用輔料及制備方法

1.3.2.1 泡騰劑

泡騰劑由酸源和堿源組成。其中檸檬酸和酒石酸一般作為主要的酸源?？紤]泡騰片的口感和外觀，以及制備泡騰片的成本，然后通過預試驗對比發(fā)現(xiàn)檸檬酸的口感更好，且酒石酸溶于水易產(chǎn)生渾濁，所以檸檬酸是作為酸源的首要選擇；常用的堿源有碳酸鈉和碳酸氫鈉，而碳酸鈉口感較差，故選擇碳酸氫鈉作為堿源。

1.3.2.2 填充劑

填充劑的種類也多種多樣，生活中常見的就是淀粉、乳糖、糊精幾種?？紤]到口服泡騰片需要在水中完全溶解，而乳糖能溶于水且不易吸水，能夠使制備的成品更加優(yōu)良，所以選擇乳糖作為填充劑。

1.3.2.3 黏合劑

加入黏合劑時，普遍選擇水、乙醇或者聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）乙醇溶液作為黏合劑。由于泡騰片遇水則反應，而PVP乙醇溶液黏性過大，導致壓片黏沖，故選用無水乙醇作為黏合劑。

1.3.2.4 潤滑劑

潤滑劑有水溶性潤滑劑和水不溶性潤滑劑兩種。口服泡騰片需要考慮片劑在水中溶解完全，而且溶液不渾濁，所以一般選擇水溶性好的作為潤滑劑。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000 或聚乙二醇 4000、十二烷基硫酸鈉、苯甲酸鈉等幾類潤滑劑水溶性都良好，考慮它們的成本和潤滑性，選用PEG6000更為適宜。

1.3.2.5 甜味劑

口服泡騰片中為了改善口感，一般都會添加甜味劑來調(diào)味。由于阿斯巴甜甜度大，能夠有效地改善檸檬酸所造成的酸澀的口感，而且它不參與一般糖代謝，亦不會被微生物降解，適合糖尿病患者食用[15]，并且節(jié)約成本，非常適用，故可選擇阿斯巴甜作為甜味劑。

1.3.2.6 制備工藝

泡騰片的制粒方法包括酸堿混合非水制粒、酸堿分別濕法制粒、干法制粒、直接壓片和聚乙二醇包裹法等。經(jīng)預試驗發(fā)現(xiàn)，酸堿分別濕法制粒耗時長，工藝麻煩且壓片效果不理想；干法制粒和直接壓片制得的泡騰片容易裂片，且極易黏沖；聚乙二醇包裹法工藝制備耗費時間太長且工藝復雜；而酸堿混合非水制粒壓片效果最好，片劑整潔美觀，顆粒流動性好，崩解完全，黏沖現(xiàn)象少。因此選擇酸堿混合非水制粒方式進行制粒。

1.3.3 蛹蟲草提取物泡騰片的制備

按比例要求稱取蛹蟲草提取物凍干粉、乳糖、檸檬酸、碳酸氫鈉、阿斯巴甜，充分混和均勻后加入無水乙醇，制得軟材。通過24目篩進行制粒，在真空干燥箱中干燥3 h，干燥溫度為50℃，取出后整粒，然后加入PEG6000混勻，壓片，即得。泡騰片片重規(guī)格定為1.0 g。

1.3.4 蛹蟲草提取物泡騰片配方的篩選

1.3.4.1 蛹蟲草提取物添加量的選擇

蛹蟲草提取物是泡騰片的主要原料成分，它的添加量對蛹蟲草泡騰片的口感、湯色、風味有明顯的影響。分別稱取 0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13 g蛹蟲草提取物溶解于100 mL水中，該添加量相當于質(zhì)量為1.0 g蛹蟲草提取物泡騰片中蛹蟲草提取物含量分別為8%、9%、10%、11%、12%、13%。以湯色、口感與香氣（各5分）為評價標準[16]對蛹蟲草提取物溶液進行感官評價，以此篩選蛹蟲草提取物添加量。具體評分標準見表1。

表1 蛹蟲草提取物添加量評分標準Table 1 Evaluation standard for the amount of Cordyceps militaris extract added

1.3.4.2 泡騰劑酸堿比例的選擇

泡騰劑的酸堿配比影響泡騰效果。準確稱取1.0 g碳酸氫鈉（NaHCO3）分別和 0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 g檸檬酸一起加到100 mL去離子水中，計算減少的質(zhì)量，即為CO2產(chǎn)生量，再測量溶液的pH值，以CO2產(chǎn)生量和溶液的pH值為評價指標確定酸堿配比。

1.3.4.3 甜味劑阿斯巴甜添加量的選擇

甜味劑阿斯巴甜能有效改善檸檬酸的酸澀口感，但添加量不適當反而會增加泡騰片的酸澀口感，因此應合理確定其添加量范圍。分別準確稱取一定量的甜味劑阿斯巴甜于杯中，各注入70 mL涼開水，然后進行品嘗并作出感官評價[17]，以確定阿斯巴甜添加量。

1.3.5 正交試驗優(yōu)化蛹蟲草提取物泡騰片制備工藝

張真真等[18]報道，泡騰劑的酸源和堿源的總量控制在40%～50%，崩解效果最好，故選擇泡騰劑總質(zhì)量為40%、45%、50%3個水平進行正交試驗。固定潤滑劑PEG6000的質(zhì)量分數(shù)5%，以乳糖作填充劑，按照1.2.3方法制備蛹蟲草提取物泡騰片，每組制備3批，分別以感官評價、崩解時限、硬度為考察指標設計L9（34）正交試驗，對蛹蟲草提取物添加量、泡騰劑酸堿比例、泡騰劑總質(zhì)量、甜味劑阿斯巴甜添加量進行進一步的優(yōu)化分析，從而確定出泡騰片最優(yōu)配方。試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

將不同配方的蛹蟲草提取物泡騰片溶于水后，由10位接受過感官試驗訓練的感官評審員對泡騰片進行感官評價，以色澤、組織狀態(tài)、風味、口感為評價指標，對泡騰片進行評分，10人評分結果取算數(shù)平均值，作為每項處理的得分。蛹蟲草提取物泡騰片的感官評價標準見表3。

表3 蛹蟲草提取物泡騰片感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standard of Cordyceps militaris extract effervescent tablets

1.3.6 工藝驗證

按1.3.5項下所得最佳工藝條件制備泡騰片3批，以崩解時限、pH值、硬度為指標進行工藝驗證。

1.3.7 蛹蟲草提取物泡騰片的質(zhì)量分析

1.3.7.1 外觀檢查

片劑表面應光滑完整，其大小和色澤均勻。

1.3.7.2 重量差異檢查

隨機取樣品20片，先稱定總重量，再對單片進行稱量。計算出樣品平均重量，比較單片重量與平均重量。片劑重量在0.3 g及0.3 g以上的，重量差異限度為±5%，超出重量差異限度的不能大于2片，并不能有1片超出限度1倍[19]。

1.3.7.3 崩解時限測定

隨機取樣品6片，分別放進6個250 mL燒杯中，再加入200 mL的常溫蒸餾水。燒杯中迅速產(chǎn)生大量氣泡，氣泡消失完全后，泡騰片應溶散徹底無殘留。規(guī)定泡騰片必須在5 min內(nèi)崩解完全[19]。記錄下樣品崩解的時間，然后計算出平均值。

1.3.7.4 pH值測定

隨機取蛹蟲草泡騰片6片，分別放進100 mL燒杯中，加入100 mL常溫蒸餾水，等待泡騰片完全溶解。然后測量各燒杯中溶液pH值。

1.3.7.5 硬度考察

取樣品片劑5片，用片劑硬度儀檢測泡騰片硬度。一般的片劑要求在50 N以上就能合格。

1.3.7.6 發(fā)泡量檢查

由于CO2容易揮發(fā)且溶于水，量取的體積不準確。因此泡騰片發(fā)泡量的檢查采用質(zhì)量損失法，隨機取樣品10片，用研缽磨成細粉，精密稱取適量片劑粉末（1 g左右），放進含水燒杯中，含水燒杯已經(jīng)精密稱定質(zhì)量，等待氣泡消失完全，再精密稱量整個燒杯的質(zhì)量。平行測量6組，分別計算單位質(zhì)量CO2的體積，并取平均值[20]。

1.3.7.7 泡騰片中蟲草多糖的含量測定

采用苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量[21]。

1.3.7.8 泡騰片中蟲草素的含量測定

采用高效液相色譜法測定蟲草素含量[22]。

1.3.8 統(tǒng)計分析方法

使用SPSS24.0數(shù)據(jù)分析軟件對結果進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草提取物泡騰片配方篩選結果

2.1.1 蛹蟲草提取物添加量的選擇

考察不同蛹蟲草提取物添加量對泡騰片感官的影響，試驗結果見表4。

表4 蛹蟲草提取物添加量對泡騰片感官品質(zhì)的影響Table 4 Effect of addition amount of Cordyceps militaris extract on sensory quality of effervescent tablets

由表4可知，感官品質(zhì)評分隨著蛹蟲草提取物添加量的增加而呈現(xiàn)拋物線形的變化趨勢。當添加量為11%時，感官評價分值最高，而當添加量繼續(xù)增加，感官品質(zhì)反而下降。這是因為蛹蟲草本身含有魚腥味和澀味，當蛹蟲草提取物添加過多時會導致口感不好，且顏色變深，而添加量過少則沒有蛹蟲草特征味道。因此，選擇蛹蟲草提取物添加量為10%、11%、12%這3個水平進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。

2.1.2 泡騰劑酸堿比例的選擇

泡騰劑比例對產(chǎn)氣量和溶液pH值的影響見表5。

表5 泡騰劑配比對產(chǎn)氣量和溶液pH值的影響Table 5 Effect of formula on gas-producing amount of effervescent agents and solution pH value

續(xù)表5 泡騰劑配比對產(chǎn)氣量和溶液pH值的影響Continue table 5 Effect of formula on gas-producing amount of effervescent agents and solution pH value

結果表明，當碳酸氫鈉與檸檬酸的質(zhì)量比為1∶1.2時，產(chǎn)氣量比較豐富。隨著檸檬酸比例的增大，溶液pH值會越來越大。但是當pH值過大時，泡騰片溶液容易發(fā)澀，pH值太小，也對口感不利。綜合考慮，選取泡騰崩解劑的酸堿比在 1.1∶1～1.3 ∶1（g/g）范圍內(nèi)進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。

2.1.3 甜味劑阿斯巴甜的選擇

甜味劑阿斯巴甜的選擇見表6。

表6 阿斯巴甜添加量對泡騰片甜味的影響Table 6 Effect of addition amount of aspartame on sweet degree

泡騰片的口感通常會受到甜味劑添加量的影響，因為甜味過濃或過淡都會使品嘗者感到不舒服，因此本研究中添加的阿斯巴甜量設定為0.25%～0.35%，選取添加量為0.25%、0.30%、0.35%這3個水平進行后續(xù)的正交優(yōu)化試驗。

2.2 蛹蟲草提取物泡騰片配方優(yōu)化正交試驗

泡騰片正交優(yōu)化試驗結果如表7所示。

表7 泡騰片配方優(yōu)化正交試驗結果Table 7 Results of orthogonal tests for the formula optimization of effervescent tablets

續(xù)表7 泡騰片配方優(yōu)化正交試驗結果Continue table 7 Results of orthogonal tests for the formula optimization of effervescent tablets

由表7可知，所考查的3個因素中各因素對感官評分的影響順序是A＞D＞B＞C，蛹蟲草提取物添加量對感官評分影響最大，水平優(yōu)劣次序為A2＞A1＞A3，其次是甜味劑阿斯巴甜添加量，其水平優(yōu)劣次序為D1＞D3＞D2；對崩解時限的影響順序為 C＞B＞A＞D，泡騰劑總質(zhì)量對崩解時限影響最大，其次為泡騰劑酸堿比例，水平優(yōu)劣次序分別為 C3＞C2＞C1，B3＞B2＞B1；對硬度的影響順序為C＞B＞A＞D，泡騰劑總質(zhì)量對硬度影響最大，其次為泡騰劑酸堿比例，水平優(yōu)劣次序分別為C3＞C2＞C1，B3＞B2＞B1，綜合考慮多因素作用，最終確定最佳配比為A2B3C3D1，即蛹蟲草提取物質(zhì)量分數(shù)為11%，泡騰劑總質(zhì)量分數(shù)50%，檸檬酸和碳酸氫鈉的酸堿比例為1.3∶1（質(zhì)量比），甜味劑阿斯巴甜質(zhì)量分數(shù)0.25%。

2.3 工藝驗證試驗結果

按所得最佳工藝條件制備蛹蟲草提取物泡騰片3批，進行工藝驗證，結果見表8。

表8 工藝驗證試驗結果Table 8 Validation of the optimized formulation

結果表明，正交試驗確定的最佳工藝較穩(wěn)定，符合2015年版中國藥典的規(guī)定。

2.4 蛹蟲草提取物泡騰片的質(zhì)量分析

按照正交試驗得出的最優(yōu)配方制備的蛹蟲草提取物泡騰片，外觀光滑完整，大小和色澤均勻，沖泡后溶液澄清透明，味道酸甜可口，并伴有蛹蟲草特有香味。平均片重（0.994±0.01）g，相對標準偏差為1.01%，重量差異限度均小于5%；崩解效果較好，均在5 min內(nèi)崩解；樣品的硬度都達到了一般片劑的要求，均在50 N以上，各指標均符合2015年版中國藥典的規(guī)定。所得溶液均呈弱酸性，1 g泡騰片粉末平均產(chǎn)生CO2體積（23.95±0.60）mL（相對標準偏差=2.50%）。按1.3.7.7、1.3.7.8項下方法求出，蛹蟲草提取物泡騰片中蟲草多糖的含量為（10.01±0.08）mg/g（相對標準偏差=0.80%），蟲草素的含量為（0.65±0.01）mg/g（相對標準偏差=1.54%）。

3 結論

本試驗旨在研究蛹蟲草提取物泡騰片的制備工藝，可為其他食用菌的開發(fā)提供參考，具有較好的市場發(fā)展前景。本研究確定的泡騰片制備工藝操作方便、簡單，黏沖少，出片順利。

采取酸堿混合非水制粒的方法制備泡騰片，由于酸與堿完全接觸，容易吸潮而導致泡騰片鼓泡、變形而失去泡騰效果，所以制好的泡騰片劑應該保存在干燥密閉的條件下。

蛹蟲草中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，且具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降低血糖等功效，在藥用和保健中起著非常重要的作用。醫(yī)學上和市場上對于蛹蟲草的研究和開發(fā)，為當代醫(yī)學提供了更多的研究方向和藥用價值。在本研究中，既保證了泡騰片性能，還保留了蛹蟲草的特有風味，提升了蛹蟲草的綜合開發(fā)利用水平，為開發(fā)蛹蟲草新劑型奠定基礎。

本研究并未對制得的泡騰片進行生理活性評價，因此在以后的工作中，還應該進行泡騰片的活性評價研究，繼續(xù)深入在體內(nèi)藥代動力學方面的研究探討，以考察本試驗所制得的泡騰片在藥效和生物利用度方面的作用情況。