林志鵬 李錦濯 曾倩雯 黃顯瓊 孫仁山

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院皮膚科，重慶，400042

城市大氣細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)主要來源于機動車尾氣排放和工業(yè)生產(chǎn)等，其粒徑≤2.5 μm，可長期懸浮于空氣中，成分中富集的有機碳、無機碳、金屬無機鹽及多環(huán)芳烴等可引起一系列呼吸和心血管系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。近年發(fā)現(xiàn)，PM2.5能導(dǎo)致過敏性疾病如哮喘[2]、蕁麻疹[3,4]等發(fā)病增加。大氣PM2.5濃度每增高10 μg/m3，過敏性皮膚病如濕疹、特應(yīng)性皮炎(AD)的發(fā)生危險增加0.52%[5]。肥大細(xì)胞(mast cell)是速發(fā)型超敏反應(yīng)的核心[6]，外界過敏原如塵螨、顆粒物等可以激活肥大細(xì)胞表面的蛋白酶激活受體2(proteinase-activated receptor-2，PAR2)引起過敏炎癥，促進(jìn)組胺、胰蛋白酶和白細(xì)胞介素4(IL-4)等分泌[7,8]。實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5可以刺激肥大細(xì)胞(LAD2)脫顆粒釋放組胺并生成活性氧(ROS)，引起細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是含有巰基(-SH)的抗氧化劑。研究表明NAC可顯著抑制氧化應(yīng)激與氣道炎癥，從而控制哮喘等發(fā)作，提示其具有良好的抗過敏作用[10]。本實驗以NAC體外作用PM2.5誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒模型，測定PAR2表達(dá)和β-氨基己糖苷酶(β-Hex)、IL-4釋放水平，探索肥大細(xì)胞PAR2在NAC抗過敏中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 小鼠肥大細(xì)胞株(P815，中科院上海細(xì)胞庫)。

1.2 試劑與設(shè)備 DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)；胎牛血清、青-鏈霉素(美國Gibco公司)；NAC、ROS檢測試劑盒、CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)；小鼠IL-4 ELISA 試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗小鼠IgG(北京索萊寶公司)；PAR2小鼠單克隆抗體、β-actin抗體、氨基己糖溶液(美國Sigma公司)；曲拉通 X-100溶液、甘氨酸緩沖液、PBS緩沖液(上海生工生物公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；冷凍干燥機(美國Labconco公司)；電泳儀、電泳槽和蛋白質(zhì)含量測定儀(美國Bio-rad公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國MD公司)。

1.3 PM2.5的制備 PM2.5收集濾紙來自于重慶市九龍坡區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督局下屬檢測站(圖1)，采集期間(2018年10～12月)市區(qū)PM2.5日平均濃度[11]為48.88 μg/m3。改良Jin等[12]的方法提取PM2.5，步驟如下：將濾紙剪成1 cm×1 cm小塊，浸于雙蒸水中振蕩60 min，過濾振蕩液，12000 g冷凍離心5 min取上清，真空冷凍干燥48 h，鈷-60輻照滅菌后，存放于-20℃。臨用前溶于DMEM培養(yǎng)液，充分振蕩，制成混懸液(10 mg/mL)。

圖1 PM2.5采樣點示意圖

1.4 細(xì)胞模型建立及分組 采用PM2.5刺激肥大細(xì)胞脫顆粒建立模型。取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)后接種于6孔板(濃度5×105個/mL)，同步處理24 h。設(shè)空白組、模型組、NAC高、中、低劑量組(濃度分為100、50、25 μmol/L)。空白組、模型組用等體積DMEM培養(yǎng)液代替受試藥物NAC；NAC各劑量組加入不同質(zhì)量濃度的藥物，每個濃度設(shè)4個副孔。37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)6 h，加入PM2.5混懸液，調(diào)節(jié)終濃度100 μg/mL(空白組加入等量DMEM培養(yǎng)液)，進(jìn)行下述實驗。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞活力檢測 PM2.5處理6、12 h后，采用CCK-8法分別檢測各組細(xì)胞增殖情況。

1.5.2 ROS釋放檢測 PM2.5處理6、12 h后，細(xì)胞重懸于DCFH-DA(10 μmol/L)熒光探針中，避光培養(yǎng)30 min，PBS緩沖液洗滌3次后，吸取200 μL 接種96孔板，酶標(biāo)儀測定488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長下的熒光值。

1.5.3 β-Hex釋放率測定 PM2.5處理6 h后，吸取50 μL上清于96孔板，加入50 μL氨基己糖底物(1 mmol/L)；總酶組中加入500 μL 1% 曲拉通X-100裂解細(xì)胞后，吸取50 μL上清于96孔板，加入50 μL等量氨基己糖底物；于37℃培養(yǎng)2 h，加入100 μL終止液(200 mmol/L pH 10.7甘氨酸緩沖液)后，酶標(biāo)儀檢測410 nm光密度OD值。以PM2.5實驗組β-Hex釋放量與曲拉通組裂解細(xì)胞后總β-Hex釋放量之比，衡量PM2.5刺激細(xì)胞后的β-Hex釋放率。β-Hex釋放率(%)=[(OD實驗-OD空白)/(OD總酶-OD空白)]×100%。

1.5.4 IL-4分泌量檢測 PM2.5處理6 h后，取500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，500 g離心5 min，取上清。按小鼠IL-4 ELISA試劑盒說明檢測IL-4濃度。

1.5.5 PAR2蛋白檢測 PM2.5處理6 h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定細(xì)胞樣品蛋白濃度，每孔取蛋白20 μg，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜、在5%脫脂奶粉-TBST室溫封閉2 h，分別加入PAR2抗體(1∶1000稀釋)與β-actin抗體(1∶5000稀釋)，4℃過夜。加入二抗(1∶5000稀釋)，37℃反應(yīng)1 h，用TBST洗滌3次，每次15 min。采用Western blot印跡法進(jìn)行蛋白檢測，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值之比作為蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性比較 模型組細(xì)胞存活率均顯著低于空白組與中、高劑量NAC組(P<0.05)，見表1。說明NAC可能改善PM2.5對肥大細(xì)胞增殖活性的損害，提升存活率。

表1 各組細(xì)胞存活率比較 %

2.2 各組ROS生成比較 PM2.5刺激6 h后，模型組ROS生成量顯著高于空白組與中、高劑量 NAC組(P<0.05)；PM2.5刺激12 h后，模型組ROS生成量顯著高于空白組與各NAC濃度組(P<0.05)，低劑量組ROS顯著高于高劑量組(P<0.05)，見表2。說明NAC可能抑制肥大細(xì)胞ROS，濃度越高，抑制作用越強。

表2 各組ROS生成比較

2.3 各組β-Hex釋放率比較 模型組β-Hex釋放率高于空白組(P<0.05)；各NAC濃度組均能抑制β-Hex釋放，而高劑量組釋放率顯著低于其他各組(P<0.05)，見表3。說明NAC可能抑制肥大細(xì)胞活化釋放β-Hex，且濃度越高，抑制作用越強。

2.4 各組IL-4分泌量比較 模型組IL-4分泌高于空白組(P<0.05)；各NAC濃度組均能減少IL-4分泌，且高劑量組抑制作用強于模型組與低劑量組(P<0.05)，見表3。說明高劑量NAC可能降低肥大細(xì)胞IL-4的分泌。

表3 各組β-Hex釋放率、IL-4分泌比較

2.5 各組PAR2蛋白表達(dá)比較 模型組與空白組比較，PAR2蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)；各NAC濃度組PAR2蛋白表達(dá)量較模型組顯著降低(P<0.05)，低劑量組表達(dá)量高于中、高劑量組(P<0.05)，見圖2。說明NAC可能抑制PAR2蛋白表達(dá)。

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05

3 討論

近年來，我國城市PM2.5污染程度仍在加重，尤其是冬季霧霾，除了危害呼吸、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)，增加健康負(fù)擔(dān)，更是各類過敏性疾病發(fā)病率迅速增加的重要原因。作為各型超敏反應(yīng)的核心，肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞脫顆?？梢葬尫沤M胺、類胰蛋白酶、白三烯(LTs)、白介素(IL)及腫瘤壞死因子(TNF-α)等I型超敏反應(yīng)介質(zhì)[13]，誘發(fā)肥大細(xì)胞“細(xì)胞因子瀑布”，加劇過敏炎癥反應(yīng)[6，14]。早期研究指出，蛋白酶激活受體2(PAR2)在過敏性炎癥的病理過程中起到重要作用[15]。Li等[16]證實塵螨可通過PAR2受體激活氣道上皮細(xì)胞，促進(jìn)IL-6、IL-8和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。除此之外，PM2.5能夠提高細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響NF-κB、ASK1-JNK及p53等胞內(nèi)信號通路，上調(diào)炎性因子基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)[17]，也可直接激活氧化鈣調(diào)蛋白激酶(Ox-CaMKII)，啟動脫顆粒，引發(fā)過敏性疾病[18]。故探索PM2.5誘發(fā)過敏性疾病的防治措施具有重要的價值和意義。

NAC是左旋精氨酸的衍生物，具有多種藥理活性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，清除體內(nèi)氧自由基，有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，已廣泛用于臨床治療。李劍等[20]發(fā)現(xiàn)NAC可降低哮喘患者TNF-α、IL-6，改善呼吸峰值流量(PEF)，起到控制氣道炎癥效果。NAC聯(lián)合糖皮質(zhì)激素能調(diào)節(jié)重度哮喘患者TNF-α和IL-8水平，改善肺功能[21]。已有文獻(xiàn)報道，IL-29可上調(diào)肥大細(xì)胞PAR-2表達(dá)并增加IL-4分泌，而使用阻斷抗體AG490或LY294002后肥大細(xì)胞IL-4釋放水平降低[22]。此外，PAR-2受體的激活，可促進(jìn)肥大細(xì)胞(P815)分泌Th2 細(xì)胞因子IL-4，從而調(diào)控 IgE 合成型 B 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，參與過敏性炎癥反應(yīng)[7]。本實驗結(jié)果表明，NAC能夠提高PM2.5體外刺激肥大細(xì)胞后的細(xì)胞存活率，調(diào)節(jié)ROS生成，阻斷PAR2蛋白的表達(dá)，抑制脫顆粒釋放β-Hex和IL-4。提示NAC可能減輕PM2.5對肥大細(xì)胞的損傷，抑制其活化脫顆粒。

肥大細(xì)胞是蕁麻疹的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)皮膚風(fēng)團周圍的真皮組織肥大細(xì)胞發(fā)生活化、脫顆粒并釋放局部炎性細(xì)胞因子和神經(jīng)肽等，誘導(dǎo)Th2型炎癥[23]。此外，PAR2受體可影響肥大細(xì)胞活化，改變皮膚細(xì)胞和感覺神經(jīng)間的聯(lián)系，在皮膚神經(jīng)性炎癥發(fā)展中起重要作用[24]。在小鼠皮炎模型中，應(yīng)用PAR2受體抑制劑PZ-235可抑制肥大細(xì)胞IL-4分泌，緩解皮膚瘙癢癥狀，對AD有良好療效[25]。Kim等[26]研究提示抗氧化劑NAC可以抑制支氣管上皮細(xì)胞(A549)內(nèi)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)和ROS水平，改善PAR2介導(dǎo)的過敏性炎癥，降低支氣管高反應(yīng)性。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)中藥 “防風(fēng)”能通過阻斷PAR2受體，降低IL-6與組胺分泌，調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞功能起到抗過敏作用[27]，這與本研究結(jié)果相似。同時，近年還發(fā)現(xiàn)其它抗氧化劑如維生素E[28]、Trametes Orientalis多糖[29]、橘紅[30]等也具有抗過敏及免疫調(diào)節(jié)作用，能夠減輕PM2.5導(dǎo)致的肺部氧化應(yīng)激和炎癥損傷。實驗初步發(fā)現(xiàn)，NAC對肥大細(xì)胞活化具有一定的保護作用，但對PAR2受體的具體作用途徑仍不明確，有待利用PAR2阻斷劑做進(jìn)一步研究。

綜上所述，NAC可能通過抑制PAR2表達(dá)，調(diào)節(jié)PM2.5誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化，減少相關(guān)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，達(dá)到抗過敏的作用，從而進(jìn)一步為藥物防治PM2.5誘發(fā)過敏疾病提供新思路。