王嵐琦 楊夢(mèng)波 王孝盼 鞠 強(qiáng)

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院皮膚科，上海，200127；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海，200025

CCL20是CC亞族的趨化因子，曾被稱為“巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α”(macrophage inflammation protein 3α, MIP3α)。人體內(nèi)的多種組織和細(xì)胞均可表達(dá)CCL20，正常人皮膚中，角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)極少量地組成性表達(dá)CCL20。CCL20具有招募表達(dá)其特異性配體CCR6的細(xì)胞聚集在上皮組織的作用。不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞和外周血中Th17細(xì)胞表面表達(dá)CCR6，被CCL20招募聚集至皮膚中發(fā)揮作用[1]。銀屑病患者的皮損中，CCL20有免疫監(jiān)視功能，其高表達(dá)時(shí)顯示過(guò)強(qiáng)的“免疫監(jiān)視”和皮膚屏障的破壞，并且與病情成平行關(guān)系。銀屑病皮損處高表達(dá)的白介素(interleukin, IL)1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-17均強(qiáng)有力地刺激CCL20的表達(dá)[2]?？ú慈际蔷S生素D衍生物，具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化[3]和巨噬細(xì)胞活化的作用[4]，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。目前已知卡泊三醇可以調(diào)節(jié)銀屑病患者外周血和皮損處Th17細(xì)胞遷移[5]，但卡泊三醇調(diào)節(jié)KC中CCL20表達(dá)的相關(guān)性研究報(bào)道仍較少。為此，我們探討卡泊三醇對(duì)于KC中CCL20的表達(dá)及下游相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人TNF-α蛋白, CCL20酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自R&D公司；PBS，DMEM培養(yǎng)基，胰酶，胎牛血清，無(wú)血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Trizol RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(日本TaKaRa公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)BioRad公司)；卡泊三醇，SB202190, SP600125, U0126, CAPE(美國(guó)Sigma公司)。兔抗人p-p38, p38，p-ERK, ERK，p-p65, p65, β-tubulin一抗(美國(guó)CST公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司)，BCA蛋白分析試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)BioRad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人原代角質(zhì)形成細(xì)胞由上海交通大學(xué)免疫所李寧麗教授惠贈(zèng)，5～9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞，添加5%牛下丘腦提取物，5 ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子。細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每?jī)商旄鼡Q1次培養(yǎng)液。待培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋皿底70%～80%融合時(shí)，用胰酶消化傳代。

1.3 細(xì)胞刺激 角質(zhì)形成細(xì)胞接種于12孔板(1×105細(xì)胞/孔)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合，分別應(yīng)用TNF-α(10 ng/mL)，卡泊三醇(10/100/1000 nM)，TNF-α+卡泊三醇，TNF-α+卡泊三醇+SB202190(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+SP600125(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+U0126(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+CAPE(1 μM)刺激。SB202190, SP600125, U0126，CAPE預(yù)刺激1 h后加入卡泊三醇刺激1 h，隨后加入TNF-α。DMSO作為對(duì)照組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中CCL20mRNA水平 TRIzol提取人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中RNA，使用TaKaRa試劑盒按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，檢測(cè)基因及引物序列見(jiàn)表1，GAPDH作為內(nèi)參。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因及引物序列(5’-3’)

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CCL20分泌量 將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞接種于96孔板中(2×104/孔)，刺激同上，24 h后收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)，并設(shè)定空白對(duì)照孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.6 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中p38，ERK，NF-κBp65磷酸化水平 將人角質(zhì)形成細(xì)胞接種于12孔板中(2.5×105個(gè)/孔)，24 h后待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，卡泊三醇1000 nM預(yù)刺激1 h，隨后給予10 ng/mL TNF-α刺激，繼續(xù)培養(yǎng)15/30/60 min后，RIPA裂解液提取總蛋白，刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL微量離心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10000 g離心5 min，吸取上清液留存，棄沉淀。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，封閉液封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入兔抗人p-p38、p-ERK、p-p65、p38、ERK、p65一抗，4℃孵育過(guò)夜，加人羊抗兔二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，并采用LSD校正進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 卡泊三醇抑制TNF-α誘導(dǎo)KCs中CCL20的表達(dá) 同TNF-α 組相比，卡泊三醇(100 nM)抑制CCL20mRNA表達(dá)(P<0.001)，見(jiàn)圖1a，卡泊三醇刺激細(xì)胞3 h或6 h后，細(xì)胞中CCL20mRNA表達(dá)量下降?？ú慈家种艭CL20的蛋白表達(dá)，并且呈劑量相關(guān)(P<0.001)，見(jiàn)圖1b。

1a：卡泊三醇(100 nM)預(yù)刺激人原代角質(zhì)形成細(xì)胞1 h，隨后給予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角質(zhì)形成細(xì)胞3 h，Q-PCR檢測(cè)CCL20mRNA的表達(dá)；1b：卡泊三醇(10/100/1000 nM)預(yù)刺激人原代角質(zhì)形成細(xì)胞1 h，隨后給予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角質(zhì)形成細(xì)胞24小時(shí)，ELISA檢測(cè)CCL20蛋白的表達(dá)。*：P<0.1,**：P<0.01,***：P<0.001，NS：no significance

2.2 MAPKs和NF-κB通路參與TNF-α 誘導(dǎo)CCL20的表達(dá) 使用MAKPs和NF-κB通路抑制劑(p38抑制劑：SB202190；JNK抑制劑：SP600125；ERK抑制劑：U0126；NF-κB抑制劑：CAPE)預(yù)刺激KCs，觀察TNF-α 刺激后CCL20 mRNA表達(dá)。同對(duì)照組相比，CCL20 mRNA的表達(dá)在p38抑制劑組(P=0.003)和NF-κB抑制劑組下降(P=0.006)。ERK抑制劑作用后，CCL20 mRNA的表達(dá)增加(P=0.009)。JNK抑制劑作用后CCL20 mRNA的表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.102)，見(jiàn)圖2a。在TNF-α 刺激15 min后，p38、ERK、NF-κBp65磷酸化加強(qiáng)(圖2b)。

NS：no significance;SB：SB202190;SP：SP600125 ns：not significant;con：空白對(duì)照;SB：SB202190;SP：SP600125;Cal：卡泊三醇

2.3 MAPKs參與卡泊三醇抑制TNF-α誘導(dǎo)CCL20 卡泊三醇抑制了TNF-α誘導(dǎo)的KC中p38、ERK、NF-κBp65磷酸化(圖3a)。MAPKs和NF-κB抑制劑預(yù)刺激后，使用TNF-α(10 ng/mL)和卡泊三醇(1000 nM)共刺激KC，CCL20表達(dá)在p38抑制劑組下降(P=0.048)，而ERK抑制劑促進(jìn)CCL20表達(dá)(P=0.002)。JNK和NF-κB抑制劑對(duì)于卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達(dá)無(wú)影響(JNK抑制劑組，P=0.206；NF-κB抑制劑組，P=0.290)，見(jiàn)圖3b。

3 討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病率在高加索人群為2%。銀屑病主要病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)增生，角化不全，真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[6]。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有定論，但越來(lái)越多的研究表明皮膚屏障功能受損[6]及白介素(IL)-23/Th17軸和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[7，8]。銀屑病患者KC高表達(dá)病原體識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRR)，外界病原相關(guān)分子模式通過(guò)PRR活化天然免疫系統(tǒng)，誘發(fā)皮膚炎癥[9，10]。同時(shí)壞死的KC釋放的損傷相關(guān)分子活化天然免疫系統(tǒng)，促進(jìn)皮膚炎癥[11]。皮膚屏障破壞后外界有害刺激和皮膚共生菌直接進(jìn)入真皮被樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別，遞呈細(xì)菌抗原，活化適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，招募免疫細(xì)胞聚集在皮膚，誘發(fā)炎癥[12]。同正常人相比，銀屑病患者皮損中Th17細(xì)胞，γδ T細(xì)胞數(shù)量顯著增多，這些細(xì)胞在患者的外周血中卻少于正常對(duì)照者[13，14]，提示這些產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞在疾病過(guò)程中存在著重新分布，即從外周游向皮膚。Th17細(xì)胞，γδ T細(xì)胞通過(guò)表面表達(dá)的趨化因子受體CCR6靶向皮膚遷移聚集[13，14]。CCL20是CCR6在體內(nèi)的唯一配體，其在皮膚中主要來(lái)源于KC[1]。Th17細(xì)胞，γδ T細(xì)胞活化后分泌下游效應(yīng)分子，如IL-17A、IL-17F、IL-22和TNF-α[13，15]。其中TNF-α調(diào)節(jié)皮膚抗菌肽(包括β-防御素和S100A家族)的表達(dá)[16]，下調(diào)filaggrin和黏附分子表達(dá)，導(dǎo)致皮膚屏障破壞[17]。TNF-α促進(jìn)促炎因子(IL-6，IL-1β)和趨化因子(CXCL8，CCL20)在皮膚中的表達(dá)，引起局部炎癥反應(yīng)[1，18]。FDA批準(zhǔn)了TNF-α單克隆抗體用于治療中度至重度銀屑病。多中心研究顯示TNF-α單克隆抗體可以有效改善患者生活質(zhì)量及癥狀[19]。

卡泊三醇是維生素D衍生物，能夠誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞的分化、抑制其增殖、調(diào)節(jié)免疫功能并減輕炎癥，是治療銀屑病的一線藥物?？ú慈伎梢哉{(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移[20]，銀屑病患者使用卡泊三醇治療后皮損中Th17數(shù)量下降[5]?？ú慈紝?duì)于炎癥的調(diào)節(jié)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)不同結(jié)果。有研究顯示骨化三醇抑制類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的CCL20的表達(dá)。而在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，骨化三醇加強(qiáng)了TNF-α誘導(dǎo)的CCL20的表達(dá)[21]。而在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，我們的研究顯示卡泊三醇抑制TNF-α誘導(dǎo)的CCL20表達(dá)，這可以解釋銀屑病患者接受卡泊三醇治療后皮損中Th17和γδ T細(xì)胞數(shù)量下降[5]。

MAPKs和NF-κB是炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要信號(hào)通路。在不同表皮細(xì)胞系中，TNF-α可以活化MAPKs和NF-κB通路。在呼吸道上皮中，TNF-α通過(guò)p38和ERK通路促進(jìn)CCL20的產(chǎn)生[22]；在腸道上皮中，TNF-α通過(guò)p38途徑促進(jìn)CCL20的表達(dá)[23]。我們的研究顯示TNF-α誘導(dǎo)人KCs中ERK，p38，NF-κBp65的磷酸化，參與CCL20的表達(dá)，而JNK通路在其中不起作用。有趣的是，不同于尋常MAPKs活化促進(jìn)炎癥反應(yīng)，我們研究顯示使用ERK抑制劑后，CCL20的表達(dá)進(jìn)一步上升，表明ERK的活化抑制CCL20的表達(dá)。在卡泊三醇抑制TNF-α誘導(dǎo)的CCL20過(guò)程中，NF-κB、ERK、p38MAPK均參與此過(guò)程?？ú慈纪ㄟ^(guò)抑制NF-κB p65，p38MAPK磷酸化，抑制CCL20的表達(dá)。在圖3b中顯示NF-κB和JNK抑制劑對(duì)于卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達(dá)無(wú)影響，我們認(rèn)為這兩組的發(fā)生機(jī)制有所不同。我們的研究結(jié)果顯示NF-κB參與TNF-α誘導(dǎo)CCL20產(chǎn)生的過(guò)程(圖2b)，卡泊三醇抑制NF-κB p65亞單位的磷酸化(圖3a)，因此再加入NF-κB抑制劑不會(huì)影響卡泊三醇和TNF-α共刺激組的CCL20表達(dá)，這說(shuō)明NF-κB是卡泊三醇的下游信號(hào)通路。而JNK不參與TNF-a誘導(dǎo)CCL20產(chǎn)生的過(guò)程，因此使用了JNK抑制劑后，下游CCL20的表達(dá)量無(wú)改變。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α促進(jìn)KCs產(chǎn)生趨化因子CCL20，而卡泊三醇能夠顯著抑制CCL20表達(dá)，NF-κB, ERK，p38MAPK參與此過(guò)程。