董瀟瀟 王 燕 董曉慶 許文炯 吳詠梅 張洪英

南京市疾病預(yù)防控制中心,江蘇南京,210003

我國(guó)艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的感染人數(shù)逐年增加，2018年我國(guó)估計(jì)存活HIV感染者/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)患者125萬(wàn)[1]。目前全球范圍內(nèi)尚無(wú)有效預(yù)防HIV感染的疫苗和治愈的藥物，及早診斷作為控制艾滋病流行的首要環(huán)節(jié)顯得尤為重要[2]。

HIV感染的診斷目前廣泛采用的是HIV-1抗體檢測(cè)方法[3]，但在實(shí)際應(yīng)用中存在窗口期長(zhǎng)[4]，結(jié)果不確定需隨訪(fǎng)復(fù)檢[5,6]，母嬰垂直傳播的嬰幼兒感染者受母源抗體干擾等問(wèn)題[7]。核酸擴(kuò)增技術(shù)很好的解決了這些問(wèn)題，其中，依賴(lài)于PCR技術(shù)的HIV病毒核酸RNA檢測(cè)因其良好的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性，已被推廣使用。然而PCR技術(shù)的應(yīng)用依賴(lài)于昂貴的設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室良好的基礎(chǔ)設(shè)施、可靠的電力供應(yīng)和訓(xùn)練有素的人員操作，而我國(guó)一些資源配置水平較低的地區(qū)，卻恰恰是HIV高感染率地區(qū)。因此我們急需建立一種高質(zhì)量的診斷方法，又不需要高成本配置，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展為這種需求提供了可能。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)是Piepenburg等[8]于2006 年提出的新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。與以往的等溫核酸技術(shù)例如環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)[9]和解旋酶依賴(lài)的擴(kuò)增技術(shù)(HDA)[10]相比，RPA技術(shù)將反應(yīng)溫度降低到25℃～43℃，時(shí)間縮短至20 min內(nèi)，能耗成本更低，臨床應(yīng)用也更方便。RPA利用重組酶將寡核苷酸引物插入到目標(biāo)雙鏈DNA分子的等溫?cái)U(kuò)增方法，其利用上、下游引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA的指數(shù)放大方式類(lèi)似于PCR，但是效率大大高于PCR，同時(shí)適用于RNA和DNA的擴(kuò)增。RPA可以采用熒光檢測(cè)儀，只有普通電話(huà)機(jī)大小，裝上電池即可使用，也可以采用可視化檢測(cè)。它是核酸檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)質(zhì)的飛越[8,11]。

美國(guó)有科學(xué)家嘗試將RPA技術(shù)應(yīng)用到HIV-1前體DNA檢測(cè)中，他們從63組引物探針中篩選出2組引物探針，分別針對(duì)HIV-1基因組的長(zhǎng)片段末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)和pol區(qū)，可以檢測(cè)出3個(gè)拷貝的艾滋病毒前體DNA分子，且針對(duì)基因組pol區(qū)的引物探針可以擴(kuò)增HIV-1病毒的不同重組體[12]。但在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此本文擬參考文獻(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)室建立RPA的檢測(cè)方法，觀察該方法的靈敏性和特異性，并初步應(yīng)用于臨床樣本HIV-1 DNA的檢測(cè)，期望獲得一種更為快速、簡(jiǎn)便、有效的HIV-1檢測(cè)方法。

1 資料和方法

1.1 主要儀器與試劑 Bio-Rad MiniOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀Axxin T8-ISO，由澳大利亞Axxin公司生產(chǎn)；QIAamp DNA Blood Mini Kit，購(gòu)自德國(guó)QIAgen公司；TwistAmpTM DNA amplification kits(TwistAmpTM exo kit)，購(gòu)自英國(guó) TwistDx 公司；人類(lèi)免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，購(gòu)自珠海麗珠公司；人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗體檢測(cè)試劑盒(膠體硒法)，購(gòu)自Alere公司；人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV1+2)型抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法)，購(gòu)自MP公司。

1.2 陰陽(yáng)性對(duì)照和臨床樣品 由上海生工公司合成HIV-1 pol基因并克隆至pUC57載體，命名為pHIV-1-pol，由本實(shí)驗(yàn)室保存，作為RPA實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照；以無(wú)RNA酶水作為陰性對(duì)照。13份臨床樣本，用EDTA抗凝管采集全血，離心分離血漿和淋巴細(xì)胞富集液。

1.3 臨床樣品的HIV抗體檢測(cè) 臨床樣品HIV抗體檢測(cè)流程參考《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(2015修訂版)》，采用兩種初篩試劑進(jìn)行篩查，有反應(yīng)的樣本繼續(xù)進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，檢測(cè)方法參照試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4 臨床樣品淋巴細(xì)胞富集液中DNA的提取 按照說(shuō)明書(shū)要求的比例配制AW1緩沖液和AW2緩沖液；取200 μL待提取的淋巴細(xì)胞富集液，加入20 μL QIAgen蛋白酶(或者蛋白酶K)，再加入200 μL Buffer AL，蓋緊蓋子，渦旋震蕩15 s，56℃孵育10 min；瞬時(shí)離心，去除殘留在離心管上的液滴；加入無(wú)水乙醇200 μL，蓋緊蓋子，渦旋震蕩15 s，使之充分混勻，瞬時(shí)離心；將上述混合物轉(zhuǎn)入QIAamp mini 離心管柱，14000 r/m離心1 min，棄去濾液；QIAamp mini提取柱中加入AW1緩沖液500 μL，8000 r/m離心1 min，棄濾液；加入AW2緩沖液500 μL，14000 r/m離心3 min，棄濾液，再次14000 r/m離心1 min；QIAamp mini提取柱加入AE緩沖液或雙蒸水100 μL溶解收集DNA，并于-80℃保存或直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。避免反復(fù)凍融。

1.5 引物探針 選取Boyle等[12]針對(duì)HIV-1遺傳保守的pol區(qū)的引物和探針，所有引物探針均由上海生工公司合成。

上游引物: 5’-TGGCAGTATTCATTCACAATTT TAAAAGAAAAGG-3’ 下游引物：5’-CCCGAAAATT TTGAATTTTTGTAATTTGTTTTTG-3 探針：5’-TGC TATTATGTCTACTATTCTTTCCCCFGCHCQGTACCCCC CAATCCCC/C3-spacer/-3’(F=dT-FAM，H=THF，Q=dT-BHQ)。

1.6 RPA反應(yīng)體系及程序 依據(jù)TwistAmpTM exo kit配置50 μL RPA 反應(yīng)體系，其中29.5 μL rehydration 緩沖液，2.1 μL上游引物(10 μM)，2.1 μL下游引物(10 μM)，0.6 μL HIV-1 FAM標(biāo)記的探針(10 μM)，2.5 μL鎂離子(280 mM)，3.2 μL水和10 μL模板DNA。將模板和鎂離子之外的所有試劑加入含有凍干酶制劑的反應(yīng)管中預(yù)混，并將2.5 μL MgAc 加在反應(yīng)管蓋上，將10 μL DNA模板加入反應(yīng)體系中，蓋緊后瞬時(shí)離心，放入Bio-Rad MiniOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀或恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀Axxin T8-ISO 39℃反應(yīng)10、20、30 min，實(shí)時(shí)收集FAM熒光值。

1.7 臨床樣品的結(jié)果判斷 反應(yīng)設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照(NC)和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(PC)，A值為等溫?cái)U(kuò)增的終末與起始絕對(duì)熒光差值，臨界值COV=陰性對(duì)照的平均A值+1倍標(biāo)準(zhǔn)差S，A<0按照0計(jì)算，若樣本A值≥COV即判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的拷貝數(shù)計(jì)算 檢測(cè)合成的質(zhì)粒pHIV-1-pol的濃度為116 ng/μL，堿基數(shù)為3208 bp，根據(jù)下列公式，計(jì)算重組質(zhì)粒pHIV-1-pol拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，得知該質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.3×1010copies/μL。經(jīng)過(guò)倍比稀釋?zhuān)筽HIV-1-pol拷貝數(shù)在107～100copies/μL 之間。

2.2 RPA實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 為確定本實(shí)驗(yàn)室RPA的最佳反應(yīng)時(shí)間，選擇106copies/μL的pHIV-1-pol作為DNA模板進(jìn)行RPA等溫?cái)U(kuò)增，以無(wú)RNA酶水作為陰性對(duì)照(NC)，Bio-Rad MiniOpticon檢測(cè)，對(duì)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，39℃條件下RPA反應(yīng)進(jìn)行到10 min時(shí)，106copies/μL的pHIV-1-pol曲線(xiàn)持續(xù)擴(kuò)增；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到20 min時(shí)，pHIV-1-pol擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)入平臺(tái)期；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到30 min時(shí)，pHIV-1-pol擴(kuò)增曲線(xiàn)在平臺(tái)期后繼續(xù)上升，擴(kuò)增反應(yīng)不穩(wěn)定。為排除非特異性擴(kuò)增，本研究中RPA反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間確定為20 min。為進(jìn)一步驗(yàn)證RPA反應(yīng)條件的可靠性，選擇107～105copies/μL的pHIV-1-pol作為模板等溫?cái)U(kuò)增20 min，Bio-Rad MiniOpticon檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，107～105copies/μL的pHIV-1-pol均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，陰性對(duì)照并沒(méi)有擴(kuò)增。

圖1 HIV-1 DNA的RPA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化

7～5：107、106、105 copies/μL pHIV-1-pol

2.3 RPA檢測(cè)敏感性實(shí)驗(yàn) 我們將pHIV-1-pol倍比稀釋至103～100copies/μL，驗(yàn)證RPA方法能否檢測(cè)低濃度DNA模板，從而了解該方法的檢測(cè)靈敏度，如圖3顯示，103和102copies/μL出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，可見(jiàn)該方法可以穩(wěn)定檢測(cè)102copies/μL的DNA，而101copies/μL在反應(yīng)進(jìn)行到15 min以后擴(kuò)增曲線(xiàn)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，100copies/μL和陰參未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法靈敏度較高。

3～0：103、102、101、100 copies/μL pHIV-1-pol

2.4 RPA檢測(cè)特異性實(shí)驗(yàn) 選擇經(jīng)HIV抗體篩查確定為陰性的健康人群的淋巴細(xì)胞富集液提取DNA樣本HIV Ab(-)1～3，驗(yàn)證RPA方法的檢測(cè)特異性，以106copies/μL的pHIV-1-pol作為陽(yáng)參，無(wú)RNA酶水作為陰參，結(jié)果如圖4所示，三份HIV Ab(-)樣本及無(wú)RNA酶水均未產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增，結(jié)果為陰性，只有陽(yáng)參出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

圖4 HIV-1 DNA的RPA檢測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)

2.5 恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀檢測(cè)臨床樣品 在本實(shí)驗(yàn)室條件下，確定RPA方法檢測(cè)HIV-1病毒pol區(qū)的敏感性、特異型和有效性后，我們選擇小型便攜的恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀Axxin T8-ISO重復(fù)，反應(yīng)體系和條件不變。按照資料和方法1.7臨床樣品的結(jié)果判斷的要求設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，臨界值COV經(jīng)計(jì)算為73 mV，計(jì)算過(guò)程詳見(jiàn)表1。如表2所示，經(jīng)檢測(cè)101～106copies/μL pHIV-1-pol樣本A值均大于COV，呈陽(yáng)性，100copies/μL pHIV-1-pol的A值為77，略高于COV，為弱陽(yáng)性，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果2.4中的HIV Ab(-)1-3，均為陰性，體現(xiàn)該方法的高靈敏度和特異性。進(jìn)一步選擇保存的13份待檢測(cè)臨床樣本用RPA方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用血清/血漿HIV抗體進(jìn)行驗(yàn)證。臨床樣本的結(jié)果如表3所示，經(jīng)RPA檢測(cè)有5份樣本A值大于COV，呈陽(yáng)性，其余8份樣本呈陰性反應(yīng)，其對(duì)應(yīng)血漿樣本的HIV抗體檢測(cè)結(jié)果與之完全一致。

表1 RPA方法臨界值的計(jì)算 (熒光值單位：mV)

表2 Axxin T8-ISO用于HIV-1 DNA的RPA敏感性和特異性檢測(cè) (熒光值單位：mV)

表3 臨床樣品的RPA檢測(cè)結(jié)果(熒光值單位：mV)與HIV-1抗體檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

3 討論

本研究對(duì)RPA方法在HIV-1 DNA檢測(cè)的靈敏度、特異性進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)效率不低于甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法。我們利用該方法借助小巧便攜且可視化的恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀成功對(duì)13份臨床待檢測(cè)樣本進(jìn)行了快速而準(zhǔn)確的結(jié)果判斷。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，RPA方法將核酸擴(kuò)增時(shí)間從超過(guò)1 h縮短至15～30 min[11]，本研究中的RPA最佳檢測(cè)時(shí)間為20 min。此外RPA方法的試劑采用凍干粉運(yùn)輸保存，更為方便，對(duì)儀器設(shè)備的要求也大大降低，除了本研究中采用的便攜式儀器外，有報(bào)道稱(chēng)一般水浴鍋甚至依賴(lài)人的體溫即能完成等溫?cái)U(kuò)增的過(guò)程[13，14]。雖然對(duì)儀器設(shè)備的要求降低，但該檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員操作要求較高，需避免反應(yīng)體系混合不均而造成的結(jié)果不穩(wěn)定。綜上所述RPA方法使HIV-1的快速檢測(cè)不再局限于HIV-1抗體的快速檢測(cè)試劑，只需規(guī)范的人員培訓(xùn)，就可實(shí)現(xiàn)病毒核酸現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

HIV病毒DNA主要是血漿游離病毒RNA感染CD4+T細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的病毒前體DNA，感染早期即可產(chǎn)生，抗病毒治療可以清除血漿游離的病毒和感染的活化CD4+T細(xì)胞，然而受感染的靜息期CD4+T細(xì)胞依然存在，其中的前體DNA構(gòu)成HIV-1病毒儲(chǔ)存庫(kù)，目前前體DNA是長(zhǎng)期存在于體內(nèi)無(wú)法清除的[15，16]。因此HIV-1前體DNA不僅是一個(gè)合格的早期診斷指標(biāo)，與游離病毒RNA相比更是一個(gè)特異性的檢測(cè)指標(biāo)，在嬰幼兒的早期診斷和抗病毒療效觀察方面也有重大作用。然而病毒儲(chǔ)存庫(kù)的DNA含量對(duì)檢測(cè)方法的敏感性要求極高，在本研究中，RPA成功擴(kuò)增了101copies/μL的DNA，且恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀Axxin T8-ISO檢測(cè)100copies/μL的DNA呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，具有良好的敏感性。HIV-1病毒DNA作為一個(gè)更全面更有價(jià)值的檢測(cè)指標(biāo)，具有廣泛的前景。

本研究在本實(shí)驗(yàn)室條件下建立了檢測(cè)HIV-1 DNA的RPA方法，并驗(yàn)證其靈敏度和特異性，并初步應(yīng)用到臨床樣本的檢測(cè)中，結(jié)果均較為穩(wěn)定，重復(fù)性較好。但還需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本檢測(cè)量，并拓展RPA方法檢測(cè)HIV-1DNA在嬰幼兒和治療后等人群方面的應(yīng)用，以期望更全面評(píng)價(jià)RPA方法的檢測(cè)價(jià)值。