李盼盼 楊建勛

黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱，150000

孢子絲菌病是一種人畜共患的慢性肉芽腫性疾病。1898年Schenck首次分離出孢子絲菌并報(bào)道了孢子絲菌病[1]。目前研究認(rèn)為，孢子絲菌是一種復(fù)合體，主要包括6個(gè)菌種，分別為申克孢子絲菌(S.schenckii)、巴西孢子絲菌(S.brasiliensis)、球形孢子絲菌(S.globosa)、墨西哥孢子絲菌(S.mexicana)、盧艾里孢子絲菌(S.luriei)和白孢子絲菌(S.pallida)。孢子絲菌的多種毒力因子可以抵抗宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。不同菌種的孢子絲菌毒力不同，巴西孢子絲菌的毒力最強(qiáng)，其次是申克孢子絲菌和球形孢子絲菌[2]。天然免疫系統(tǒng)是宿主細(xì)胞抵御病原微生物入侵的第一道防線，宿主細(xì)胞表面的PRRs識(shí)別與結(jié)合真菌細(xì)胞表面的PAMPs能夠快速激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。TLRs是一種廣泛存在于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞中的PRRs，不僅能夠識(shí)別細(xì)菌和病毒的病原相關(guān)分子模式，還能識(shí)別死亡或受傷細(xì)胞的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，是連接機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫的橋梁。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在宿主細(xì)胞抵抗孢子絲菌的免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本文就TLR2和TLR4的結(jié)構(gòu)與功能、信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其與孢子絲菌病的關(guān)系綜述如下。

1 TLR2和TLR4

1.1 TLR2和TLR4的結(jié)構(gòu)與功能 TLRs是一類I型跨膜蛋白，通過(guò)識(shí)別病原微生物及內(nèi)源性配體激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致多種細(xì)胞因子、趨化因子等多種誘導(dǎo)因子的產(chǎn)生。TLRs主要由胞外富亮氨酸重復(fù)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)Toll-白細(xì)胞介素-1受體(Toll-interleukin-1 receptor，TIR)3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[3]。目前在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11種TLR(TLR1～10，TLR14)[4]，其中TLR2和TLR4與孢子絲菌病發(fā)展相關(guān)。不同的TLR識(shí)別不同的PAMPs和內(nèi)源性成分。TLR2能夠與TLR1或TLR6形成異源二聚體，識(shí)別革蘭陽(yáng)性桿菌的脂聚糖和脂蛋白、支原體脂蛋白、酵母菌酵母多糖、鉤端螺旋體非典型脂多糖和熱休克蛋白70等多種成分[4]。TLR4的配體有革蘭陰性桿菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、衣原體熱休克蛋白60、逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白等，一些內(nèi)源性分子，如熱休克蛋白70、肺表面活性蛋白A、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸等也可以作為TLR4的配體[4，5]。

1.2 TLR2和TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)通路 TLR2和4與配體結(jié)合后可激活NF-κB、p38MAPK、JNK等信號(hào)傳導(dǎo)通路[6]。TLRs主要通過(guò)兩種途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，分別為髓樣分子88(myeloid differentiation primary-response protein 88，MyD88)依賴途徑和 MyD88 非依賴途徑(圖1[5])。除TLR3以外，其余TLRs均通過(guò)MyD88依賴途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，其中，TLR4可通過(guò)上述兩種途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。TLRs募集接頭蛋白 MyD88與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IL-1receptor-associated kinase，IRAK)家族分子形成復(fù)合物。復(fù)合物形成后，IRAK4磷酸化IRAK1。磷酸化的IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)結(jié)合，泛素化啟動(dòng)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding，CREB)和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。MyD88非依賴途徑又稱TRIF途徑，TLRs募集并激活干擾素β的包含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白(TIR-domain containingadaptor proteininducingIFN-beta，TRIF)，利用TRAF3和TRAF6，活化干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factor，IRF)3和7及NF-κB，從而導(dǎo)致I型干擾素的表達(dá)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[3，5]。

注：MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑：TLRs將銜接蛋白MyD88募集到其TIR結(jié)構(gòu)域，MyD88含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，另一個(gè)稱為死亡結(jié)構(gòu)域募集IRAK蛋白1、2、4。IRAK蛋白將TRAF6募集至受體復(fù)合物，復(fù)合物形成后，IRAK4磷酸化IRAK1。然后，磷酸化的IRAK1和TRAF6從復(fù)合物中解離，并在質(zhì)膜上與TAK1、TAB1及TAB2形成復(fù)合物，從而使三者磷酸化。隨后IRAK1在質(zhì)膜上降解，剩余復(fù)合物(由TRAF6、TAK1、TAB1及TAB2組成)易位至胞質(zhì)溶膠，從而導(dǎo)致TRAF6泛素化及TAK1的活化?；罨腡AK1作用于IκB激酶(IKK)復(fù)合物(由IKKα、IKKβ及IKKγ組成)，激活I(lǐng)KK，從而使IκB磷酸化，導(dǎo)致IκB泛素化及蛋白體降解，隨后釋放NF-κB至細(xì)胞核。AK1還可以激活MKK3/6-p38信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)及MKK4/7-Jun 氮-末端激酶(JNK)通路，分別導(dǎo)致CREB和AP-1的生成。TRIF途徑：TLRs募集TRIF至TIR結(jié)構(gòu)域，TLR4還可將TRAM(TRIF-adaptor molecule)募集到TIR。隨后，IKKε、TBK1及TRAF3被募集到TRIF/TIR或TRAM/TRIF/TIR復(fù)合物中，TBK1磷酸化IRF3和IRF7，后者與p300及CBP(CREB結(jié)合蛋白)復(fù)合激活干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)。TRIF還可以結(jié)合TRAF6并通過(guò)激活NF-κB產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子

2 TLR與孢子絲菌病

孢子絲菌具有多種毒力因子，如黏附力、熱耐受力、黑色素、麥角甾醇過(guò)氧化物及真菌的雙向性等[7,8]，孢子絲菌可以通過(guò)這些毒力因子抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。宿主與真菌之間的相互作用是復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的，一旦真菌侵入宿主細(xì)胞，就會(huì)激活一系列免疫應(yīng)答，其中巨噬細(xì)胞和Th17反應(yīng)參與了真菌的早期清除[9,10]。目前，越來(lái)越多的研究證明，TLR在機(jī)體抗孢子絲菌的免疫及抗真菌治療中發(fā)揮重要作用。

2.1 TLR2、TLR4與孢子絲菌病 機(jī)體清除孢子絲菌主要通過(guò)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞[11]。其中，巨噬細(xì)胞因其具有強(qiáng)大的吞噬殺傷和一定的抗原提呈功能，是抵抗孢子絲菌免疫的核心[11]。巨噬細(xì)胞被激活后，產(chǎn)生釋放炎癥因子、趨化因子及活性氧、氮等有毒物質(zhì)(NO、H2O2等)，共同抵抗病原體的入侵[12,13]。在感染早期NO和H2O2可以殺滅真菌，若產(chǎn)生過(guò)量，則會(huì)使獲得性免疫延遲，從而有利于真菌的生長(zhǎng)繁殖。如果免疫反應(yīng)被過(guò)度激活也會(huì)產(chǎn)生有害影響，因此，一些特殊的細(xì)胞因子如IL-10可以抑制樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，間接作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在感染前兩周，IL-1β、IL-2及過(guò)氧化氫(H2O2)高表達(dá)，4～6周后降低，表明三者在感染早期控制中起作用。6周后IL-1β恢復(fù)高表達(dá)，IL-10水平持續(xù)上升至感染6周，表明二者在感染后期發(fā)揮作用[14]。巨噬細(xì)胞對(duì)真菌病原體的識(shí)別很大程度上依賴于Toll樣受體。Negrini等[15]研究發(fā)現(xiàn)TLR2的缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著降低，與野生小鼠相比TLR2敲除的小鼠產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12和IL-10減少。但是并不清楚TLR2具體如何識(shí)別真菌的PAMPs并誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生促炎性因子。為了更好的了解TLR2在機(jī)體抗申克孢子絲菌免疫應(yīng)答中的作用，Negrini等[15]進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，TLR2缺失小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞在感染申克孢子絲菌后不能產(chǎn)生可檢測(cè)水平的Th1細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12等)和NO。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，野生型小鼠的脾細(xì)胞較TLR2缺失的小鼠產(chǎn)生較多的促炎細(xì)胞因子(INF-γ、IL-6)，但后者IL-17水平高于前者，僅TLR2缺失的小鼠檢測(cè)到TGF-β，且TGF-β的產(chǎn)量與IL-17的產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)[16]。這是因?yàn)?，TGF-β可以抑制Th1和Th2的分化，TGF-β的缺乏誘導(dǎo)Th1向Th17分化[17]。由此可見，TLR2在機(jī)體抗孢子絲菌的免疫中發(fā)揮重要作用。TLR2缺失導(dǎo)致免疫細(xì)胞Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生減少并出現(xiàn)Th17極化反應(yīng)，表明該受體的缺失誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)嘗試使用其他免疫途徑抵抗病原體。

目前已知巴西孢子絲菌與申克孢子絲菌在毒力、致病性、流行病學(xué)及被外周血單核細(xì)胞識(shí)別方面存在差異[18]。巴西孢子絲菌的毒力大于申克孢子絲菌，Rossato等[19]認(rèn)為一組可能與免疫逃逸相關(guān)的蛋白與巴西孢子絲菌的高毒力有關(guān)，這些蛋白包括：細(xì)胞外壁葡聚糖酶、氨肽酶I、Mn超氧化物歧化酶、熱休克70kDa蛋白1/8、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)裂解酶、孕酮結(jié)合蛋白、鼠李糖脂生物合成3-氧?；?還原酶、乙酰輔酶A水解酶。為明確TLR2在機(jī)體抗巴西孢子絲菌免疫中的作用是否與申克孢子絲菌不同，Rossato等[20]做了體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)表明TLR2缺失使巨噬細(xì)胞的吞噬作用降低，促炎細(xì)胞因子及NO產(chǎn)生減少。與申克孢子絲菌感染(細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12減少)不同的是，TLR2缺失會(huì)使感染巴西孢子絲菌的小鼠產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10、IL-6、TNF-α減少。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)在感染的前14天TLR2的表達(dá)對(duì)機(jī)體抗巴西孢子絲菌至關(guān)重要，感染28天后TLR2的缺失會(huì)誘導(dǎo)Th17反應(yīng)對(duì)抗病原體。

TLR4在機(jī)體抗孢子絲菌的免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞表達(dá)的吞噬受體增加，細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4缺失的小鼠的巨噬細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子如IL-1β、IL-12及TNF-α，并伴隨NF-κB表達(dá)降低[22]。與野生型小鼠相比，TLR4缺失的小鼠產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子及NO減少。在感染的前14天，TLR4缺失的小鼠促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-10及 IFN-γ產(chǎn)生減少，導(dǎo)致感染部位募集中性粒細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致巴西孢子絲菌酵母細(xì)胞大量繁殖，加重感染[23]。感染28天后，IL-6、IFN-γ表達(dá)增加，說(shuō)明機(jī)體可能通過(guò)其他免疫途徑抵抗孢子絲菌[23]。

表皮角質(zhì)形成細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子將中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到感染部位，參與炎癥反應(yīng)。Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)，申克孢子絲菌的分生孢子和酵母相細(xì)胞壁成分均可識(shí)別并結(jié)合表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4受體，激活NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和趨化因子(IL-6和IL-8)啟動(dòng)早期免疫應(yīng)答。

在機(jī)體抗孢子絲菌的免疫中，TLR2和TLR4通過(guò)識(shí)別孢子絲菌細(xì)胞壁的PAMPs，增加吞噬作用和促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但具體孢子絲菌細(xì)胞壁的哪種成分可以被TLR2和TLR4識(shí)別，其發(fā)揮免疫作用的機(jī)制是什么，有待進(jìn)一步研究。

2.2 TLR2、TLR4在孢子絲菌治療中的作用 孢子絲菌的治療取決于臨床表現(xiàn)、宿主免疫狀態(tài)及孢子絲菌的種類等。在抗真菌藥敏試驗(yàn)中，孢子絲菌復(fù)合物對(duì)抗真菌藥的反應(yīng)不同。在體外試驗(yàn)中，巴西孢子絲菌對(duì)伊曲康唑、泊沙康唑、特比萘芬等敏感性較強(qiáng)，申克孢子絲菌對(duì)兩性霉素B(AmB)、泊沙康唑、特比萘芬的敏感性較強(qiáng)[7]?？拐婢幬锟梢杂绊慣LRs的功能和免疫活性。AmB誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8需要TLR2的參與，敲除TLR2的小鼠巨噬細(xì)胞不能產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子。AmB可促進(jìn)中性粒細(xì)胞TLR2的表達(dá)，而抑制TLR4的表達(dá)，而AmB 脂質(zhì)體則可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞TLR4的表達(dá)，TLR4信號(hào)與AmB脂質(zhì)體刺激可協(xié)同促進(jìn)小鼠中性粒細(xì)胞抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及阻止促炎性細(xì)胞因子的分泌[25]。唑類藥物也同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以作用于TLRs，但目前沒(méi)有唑類藥物與孢子絲菌的免疫相關(guān)研究。有研究表明，煙曲霉菌絲和伏立康唑單獨(dú)應(yīng)用可上調(diào)單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)和促進(jìn) TNF-α 的分泌，兩者聯(lián)用則具有協(xié)同刺激作用。無(wú)論是聯(lián)用還是單獨(dú)刺激，TLR4的表達(dá)都沒(méi)有明顯變化[25]。TLRs與抗真菌藥物具有協(xié)同作用，可以提高藥物的抗真菌作用，進(jìn)一步研究抗真菌藥物作用于免疫系統(tǒng)的機(jī)制，可以為孢子絲菌病等真菌病提供新的治療途徑。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，TLRs在宿主細(xì)胞抗孢子絲菌的免疫中發(fā)揮重要作用，可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用和促進(jìn)炎癥因子的釋放，具有抗炎和促炎雙重作用。同時(shí)，一些抗真菌藥物發(fā)揮作用也需要TLRs的參與。但是，目前對(duì)于TLRs影響宿主免疫系統(tǒng)的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。