張燕娜　趙倩　趙伊英

摘要 為進(jìn)一步探索內(nèi)共生菌Wolbachia對(duì)土耳其斯坦葉螨生殖調(diào)控的影響，本試驗(yàn)篩選出完全感染W(wǎng)olbachia和完全不感染的土耳其斯坦葉螨品系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明：感染W(wǎng)olbachia后，葉螨體內(nèi)一些與生殖相關(guān)的基因發(fā)生明顯變化，其中3 810個(gè)基因在雌成螨中受到影響，2 885個(gè)基因在雄成螨中受到影響;其中一些參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原反應(yīng)、消化及解毒作用的基因具有明顯的性別特異性。這為內(nèi)共生菌Wolbachia引起宿主生殖調(diào)控提供了新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 土耳其斯坦葉螨; Wolbachia; 轉(zhuǎn)錄組; 生殖調(diào)控

中圖分類號(hào)：

S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018389

Transcriptome sequencing and analysis of the effects of Wolbachia on the

reproduction of Tetranychus turkestani

ZHANG Yanna， ZHAO Qian， ZHAO Yiying*

（College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi 832000， China）

Abstract

To further explore the effects of endosymbiotic bacteria Wolbachia on reproduction of Tetranychus turkestani， the completely single-infected and uninfected T.turkestani lines were established and their transcriptomes were sequenced. The results showed that after infection with Wolbachia， some genes related to reproduction in the mites showed significant change， in which 3 810 genes were affected in female adult mites and 2 885 genes were affected in male mites. Some of the genes involved in lipid transport， redox reaction， digestion and detoxification were closely related to gender specific. Our study provides a new theoretical basis for the host reproductive regulation by Wolbachia.

Key words

Tetranychus turkestani; Wolbachia; transcriptome; reproductive regulation

內(nèi)共生菌廣泛分布于昆蟲體內(nèi)，如頭、胸、腹、唾液腺、消化道等[1];其分布受許多因素影響，胚胎發(fā)育過程是最主要的因素之一[2]。昆蟲與體內(nèi)共生菌形成密切的互利共生關(guān)系[3]，內(nèi)共生菌不僅能為宿主昆蟲提供多種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，保護(hù)宿主免受病原菌侵害，抵御病原微生物侵染[6]，還能通過調(diào)節(jié)宿主耐熱性、抗藥性及改變體色等途徑提高昆蟲對(duì)環(huán)境的適合度[7-9]。由此可見，內(nèi)共生菌是調(diào)控宿主昆蟲新陳代謝及生物學(xué)性狀的重要因子。

Wolbachia是自然界迄今為止分布最廣泛的內(nèi)共生菌，約有65%的昆蟲受其感染[10-11]。作為生殖調(diào)控因子，Wolbachia可誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和性（CI），即被Wolbachia感染的雄性個(gè)體與未感染的雌性個(gè)體或感染不同株系Wolbachia的雌性個(gè)體交配后不能或很少產(chǎn)生后代，或者后代偏雄性的現(xiàn)象; 或通過孤雌生殖或殺雄作用來提高后代雌蟲比例，影響種群動(dòng)態(tài)[12-14]。研究已經(jīng)證實(shí)感染W(wǎng)olbachia后，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster幼蟲睪丸中發(fā)現(xiàn)與生殖有關(guān)的基因發(fā)生了下調(diào)，Wolbachia還可使黑腹果蠅產(chǎn)生對(duì)RNA病毒的抗性[15-16]。土耳其斯坦葉螨Tetranychus turkestani是新疆棉田的重要害螨[17-18]，其體內(nèi)Wolbachia可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生胞質(zhì)不親和作用[19-20]，還可以通過增加雌性繁殖力來影響土耳其斯坦葉螨的適合度[21]。

在本研究中，我們通過比較感染和未感染W(wǎng)olbachia的雌成螨和雄成螨的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，探究Wolbachia對(duì)宿主生殖調(diào)控的影響。發(fā)現(xiàn)Wolbachia影響葉螨許多基因的表達(dá)，包括氧化還原、消化解毒和繁殖等的基因。研究結(jié)果為節(jié)肢動(dòng)物和內(nèi)共生菌之間復(fù)雜的相互作用提供了新的見解。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)葉螨的飼養(yǎng)及樣品收集

土耳其斯坦葉螨：2016年6月采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站試驗(yàn)田，在石河子大學(xué)昆蟲生理實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱（25℃，L∥D=16 h∥8 h，RH 60%）中用豇豆Vigna sinensis飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)過程中未接觸任何藥劑。

1.2 土耳其斯坦葉螨Wolbachia感染情況檢測(cè)

土耳其斯坦葉螨總DNA的提取采用苗慧等[22]的方法：挑取單頭健壯雌成螨置于裝有25 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）的1.5 mL離心管內(nèi)，用塑料碾槌充分碾碎，然后加入2 μL蛋白酶K（10 mg/mL），以上過程均在冰上完成。然后將離心管于37℃孵育30 min，95℃初始變性5 min，離心1～2 min后，-20℃保存或取2 μL作為PCR反應(yīng)的模板，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)Wolbachia的wsp基因特異性引物WSP/F236（5′-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3′）和WSP/R44（5′-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3′），

DNA擴(kuò)增條帶為211 bp

。反應(yīng)總體系為25 μL：2 μL DNA模板，14.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×buffer，1.5 μL MgCl2，

2.0 μL dNTPs，

0.2 μL Taq DNA聚合酶，上、下游引物各1 μL; 擴(kuò)增條件： 94℃ 預(yù)變性2 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物15～20 μL，用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Bio-RadGel DocEQ凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.3 土耳其斯坦葉螨品系篩選

采用苗慧等[22]的方法篩選感染W(wǎng)olbachia的土耳其斯坦葉螨品系：在裝有海綿的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm）放入完整的新鮮四季豆葉片，根據(jù)葉片大小用濕潤(rùn)脫脂棉條將其劃分成3～5個(gè)面積近似的小室。從實(shí)驗(yàn)室品系中挑取靜Ⅲ態(tài)未經(jīng)過交配的雌螨放入小室中單獨(dú)培養(yǎng)，使其進(jìn)行產(chǎn)雄孤雌生殖，待后代雄螨發(fā)育為成螨后，將母體與其雄螨后代回交?；亟? d后，將母體轉(zhuǎn)移到新的小室中產(chǎn)卵，7 d后對(duì)母體進(jìn)行PCR檢測(cè)。將感染W(wǎng)olbachia的雌螨所產(chǎn)的后代重復(fù)以上步驟3～5代后，挑取50頭左右進(jìn)行PCR，檢測(cè)Wolbachia感染率，達(dá)到全部感染用于后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)。

抗生素處理篩選不感染W(wǎng)olbachia的品系：挑取土耳其斯坦葉螨新孵化的幼螨（尚未進(jìn)食，近白色）放在特制的玻璃皿里，用0.3%的四環(huán)素溶液飼喂48 h。在裝有海綿的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm）放入完整新鮮四季豆葉片，四周圍上濕潤(rùn)的脫脂棉條防止葉螨逃逸。將處理后的幼螨挑到葉片上，使其自然生長(zhǎng)并繁殖后代。以后每日向培養(yǎng)皿中加入蒸餾水以保持海綿的濕潤(rùn)，并及時(shí)更換新鮮的葉片。幼螨成熟后，挑取50頭左右進(jìn)行PCR，檢測(cè)Wolbachia的感染情況，若全部個(gè)體均不感染W(wǎng)olbachia，則將該品系后代繼續(xù)培養(yǎng)3至5代，用于后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)。

1.4 供試樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

收集感染和不感染W(wǎng)olbachia的土耳其斯坦葉螨雌螨（分別編號(hào)為A_W_F和A_F，F(xiàn)表示雌性;W代表Wolbachia）及雄螨（編號(hào)為A_W_M和A_M，M表示雄性），3次重復(fù)。樣品收集好后，快速置于液氮中，用于后續(xù)試驗(yàn)。采用天根TRNzol Universal總RNA提取試劑（DP431）提取供試土耳其斯坦葉螨總RNA，步驟參考說明書。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作委托北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定

為了檢測(cè)RNA-Seq分析的準(zhǔn)確性，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選基因序列，利用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證（表1），將提取的供試材料RNA通過TaKaRa公司Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，取5 μL合成產(chǎn)物稀釋10倍用于試驗(yàn)，根據(jù)TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM（商品編號(hào)為DRR420S）說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)（ABI 7300），每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)感染W(wǎng)olbachia和未感染W(wǎng)olbachia的土耳其斯坦葉螨的雌成螨和雄成螨分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。感染W(wǎng)olbachia的雌成螨平均獲得24 117 129 clean reads，比對(duì)到參考基因組的reads數(shù)目為40 957 849，占clean reads的84.91%，比對(duì)到參考基因組唯一位置的reads數(shù)目為39 924 187，占所有reads的82.78%， GC平均含量為36.93%。感染W(wǎng)olbachia的雄成螨平均獲得21 783 386 clean reads，比對(duì)到參考基因組的reads數(shù)目為35 671 706，占clean reads的81.89%，比對(duì)到參考基因組唯一位置的reads數(shù)目為34 743 136，占所有reads的79.75%， GC平均含量為36.24%（表2）。

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析

GO功能分類發(fā)現(xiàn)，在雌成螨中感染W(wǎng)olbachia 品系變化明顯的主要有以下幾個(gè)方面： 生物過程中的細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程、病毒-宿主交互作用、磷酸鹽化合物代謝過程及應(yīng)激反應(yīng);分子功能中的氧化還原酶活性、RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性及核苷酸結(jié)合蛋白（圖1a）。在感染W(wǎng)olbachia的雄成螨中包括生物過程中的有機(jī)氮化合物代謝過程、轉(zhuǎn)運(yùn)和肽生物合成;分子功能中為參與

氧化還原過程的GTP酶活性、鋅離子結(jié)合及核苷酸結(jié)合（圖1b）。在整個(gè)感染過程中，雌成螨和雄成螨都做出了相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分類注釋，并對(duì)感染W(wǎng)olbachia的雌雄螨的差異表達(dá)基因富集度最高的10個(gè)通路進(jìn)行比較，結(jié)果表明： 在雌成螨中，Wolbachia感染品系中的差異表達(dá)基因主要集中到80個(gè)KEGG途徑，其中顯著富集的代謝途徑主要涉及核糖體、氧化磷酸化、吞噬和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等（圖2a）。在雄成螨中，差異表達(dá)基因主要集中到81個(gè)KEGG途徑，其中顯著富集的代謝途徑主要涉及蛋白酶體、吞噬、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)輸出、MAPK信號(hào)通路及mRNA監(jiān)測(cè)途徑（圖2b）。

2.4 差異表達(dá)基因篩選

以不同試驗(yàn)條件下的差異表達(dá)基因的FPKM值為表達(dá)水平，進(jìn)行層次聚類（hierarchical clustering）分析，不同顏色的區(qū)域代表不同的聚類分組信息，同組內(nèi)的基因表達(dá)模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過程，結(jié)果顯示，基因表達(dá)都是特異性的，A_W_M與A_M及A_W_F與A_F之間的比較表明，每一個(gè)文庫(kù)都有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄變化（圖3），這表明有許多基因受到了內(nèi)共生菌Wolbachia的影響，盡管不能排除在篩選完全不感染W(wǎng)olbachia品系過程中殘留的抗生素引起的基因差異。

對(duì)樣本cluster后的unigene進(jìn)行差異表達(dá)分析。以log2FoldChange>1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本間的差異表達(dá)基因篩選，完全單感染W(wǎng)olbachia的雌成螨和完全不帶菌的雌成螨相比上調(diào)表達(dá)的基因有1 806個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有2 004個(gè);完全單感染W(wǎng)olbachia和完全不帶菌的雄成螨相比有1 057個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 828個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖4）。

為深入了解內(nèi)共生菌Wolbachia對(duì)葉螨的影響，我們將變化明顯的差異表達(dá)基因列表分析（表3）。已知細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是葉螨體內(nèi)最常見的幾種解毒代謝基因，受Wolbachia感染后的雌成螨中有4種P450，雄成螨中有6種P450，它們大多數(shù)為上調(diào)表達(dá)。3個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在雌成螨中全部為上調(diào)表達(dá)，而在雄成螨中編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因（107360606）為下調(diào)表達(dá)。4個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在雌（novel.5873、novel.11318、107366618和107362311）、雄螨（107366618和107362311）中均為下調(diào)表達(dá)。

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（lipocalin）是能夠結(jié)合疏水性的小分子蛋白質(zhì)，受Wolbachia感染后雌雄螨中全部表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)（雌性中4個(gè)，雄性中2個(gè); 表3）。一些與生殖功能相關(guān)的基因如組蛋白基因、編碼卵黃蛋白的基因（107370220）、innexin inx2（107366133、107365265等）、附睪分泌蛋白（107365091、107365137等）、cathepsin（107371482、107364383等）等受內(nèi)共生菌Wolbachia感染后發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)變化，這可能影響了卵子或胚胎的形成。

2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR熒光定量分析

隨機(jī)篩選雌雄螨各8個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)5個(gè)，下調(diào)3個(gè)）采用熒光定量PCR驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序結(jié)果。結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果在基因表達(dá)變幅上有一定的差異，但基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的（圖5），驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

3 討論

Wolbachia是廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的共生細(xì)菌，可通過宿主卵的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行母系遺傳，并且能夠通過不同的方法調(diào)控寄主的生殖，實(shí)現(xiàn)其在宿主種群中的穩(wěn)定存在和傳播。有研究表明Wolbachia可以在分子水平和細(xì)胞水平上與其宿主之間進(jìn)行相互作用，誘導(dǎo)宿主強(qiáng)胞質(zhì)不親和性，并提高雌性的繁殖力[21-24]。Wolbachia增加了D.mauritiana的繁殖力和生殖系干細(xì)胞的有絲分裂活性，并減少了卵巢中的程序性細(xì)胞死亡[25]，Wolbachia誘導(dǎo)的胞質(zhì)不親和性強(qiáng)度隨著雄性年齡和幼蟲階段發(fā)育顯著降低[26]。本研究中，我們選取完全感染W(wǎng)olbachia和完全不感染W(wǎng)olbachia的土耳其斯坦葉螨作為試驗(yàn)材料，挑選1日齡的雌成螨和雄成螨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示：與卵子或精子形成相關(guān)的基因，如組蛋白基因、卵黃蛋白基因、組織蛋白酶B等發(fā)生了明顯的變化。卵黃原蛋白（vitellogenin， Vtg）作為卵黃蛋白（yolk protein， YP）的前體參與卵生動(dòng)物的卵子發(fā)生。卵黃蛋白對(duì)于卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化以及將金屬離子、脂質(zhì)和維生素運(yùn)送到卵母細(xì)胞中起重要作用[27-28]。受Wolbachia感染之后，雌成螨中編碼卵黃原蛋白的基因（107370220）發(fā)生了明顯的下調(diào)，推測(cè)其可能在增強(qiáng)雌性的生殖力方面起作用。

組蛋白磷酸化是組蛋白氨基酸殘基的磷酸化修飾，是一類重要的翻譯后修飾，與有絲分裂和減數(shù)分裂的染色質(zhì)壓縮、染色質(zhì)功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的激活與抑制、DNA 損傷修復(fù)以及物質(zhì)代謝等多種機(jī)制相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，感染W(wǎng)olbachia的雄成螨中編碼組蛋白H2B的基因（107360201，log2FC-5.10）發(fā)生了顯著下調(diào)。組蛋白 H2B 主要以變異體 TH2B 和 H2BFW 形式特異地存在于雄性生殖細(xì)胞系中，體細(xì)胞系中沒有變異體，其可能參與調(diào)控特殊染色質(zhì)區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄。潘曉燕等[30]和Lu等[31]在小鼠精子發(fā)生不同階段檢測(cè)到了睪丸特異組蛋白 TH2B 的第 116 位蘇氨酸的磷酸化。研究證實(shí)， TH2B 磷酸化在減數(shù)分裂后染色質(zhì)折疊和壓縮過程中發(fā)揮了直接的調(diào)控作用。而感染W(wǎng)olbachia的雄成螨，編碼組蛋白 H2B的基因表達(dá)量大幅下調(diào)，可能會(huì)影響雄性精子的生成。H3.3 是重要的母源因子，在正常受精后精子的重編程以及體細(xì)胞核移植后供體細(xì)胞核的重編程過程中起重要作用。在正常受精過程中，H3.3 能替換精子中的魚精蛋白，將其重編程為雄原核[32]。感染W(wǎng)olbachia的雌雄成螨中編碼組蛋白H3.3的基因發(fā)生了明顯的變化，也有可能引起雄性不育現(xiàn)象的發(fā)生。

Inx 基因在動(dòng)物體內(nèi)的分布比較廣，Inx2在控制果蠅胚胎前腸的發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[33]。Lehmann 等[34] 的研究表明，Inx2蛋白和 Inx3 蛋白在膜上的分布和定位相互影響，當(dāng)沉默 Inx2 基因的表達(dá)時(shí)，Inx3 蛋白會(huì)在細(xì)胞中積累并分布紊亂，反之亦然。Inx2和Inx3基因協(xié)同表達(dá)后通過細(xì)胞內(nèi)的C端功能域相互作用形成異聚化的 Inx2∶Inx3 通道，這對(duì)果蠅胚胎上皮組織發(fā)育和胚胎表皮極性形成起著關(guān)鍵作用。如果Inx2 或 Inx3 發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致表皮上有大的皮孔形成，極端情況下甚至導(dǎo)致外皮的缺失。感染了Wolbachia后，雌雄成螨中Inx2發(fā)生了不同程度的上調(diào)或下調(diào)變化，而Inx3都趨于穩(wěn)定，這將導(dǎo)致Inx2∶Inx3的比例不平衡，影響胚胎的正常發(fā)育。

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（責(zé)任編輯：田 喆）