周 琳，李海云，閆桂溪，王越華，杜鋼軍

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004

目前糖尿病治療藥物包括胰島素、雙胍類、磺脲類及胰島素增敏劑等，雖然降糖作用肯定，抗藥性、胃腸道反應(yīng)及肝腎毒性等不良反應(yīng)明顯，且對(duì)恢復(fù)胰島功能作用不大[1-3]。芪蛭降糖片[4-6]由黃芪、水蛭、地黃和黃精組成的防治糖尿病血管并發(fā)癥的藥物。最早是林蘭教授通過結(jié)合自身治療多年糖尿病的經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)糖尿病中醫(yī)病機(jī)，遵循祛瘀益氣養(yǎng)陰法擬定的純中藥復(fù)方制劑。因此，本實(shí)驗(yàn)通過糖尿病大鼠的研究探討芪蛭降糖片是否對(duì)糖尿病胰島損傷有保護(hù)作用，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索其對(duì)胰島損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品

芪蛭降糖片(購(gòu)自廣東合威制藥有限公司，批號(hào)：180102)；格列本脲片(購(gòu)自天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：1712065)；鹽酸二甲雙胍片(購(gòu)自上海華氏制藥有限公司，批號(hào)：AAu/4623)。

1.2 試劑

魚躍血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，批號(hào)：1704532)；鏈脲佐菌素(北京普博斯生物科技有限公司，批號(hào)：615K0321)；糖化血清蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：K187413H)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：AK16305)；胰島素試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司，批號(hào)：E02I0004)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠200只，體質(zhì)量150±20 g，雌雄各半，河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

三諾血糖測(cè)試儀(億家康誠(chéng)醫(yī)療器械專營(yíng)店，型號(hào)：HEA-232)；高速冷凍離心機(jī)(山東梁嘉機(jī)械設(shè)備有限公司，型號(hào)：XPN-80)；酶標(biāo)儀(濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：HBS-1096A)。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立

在Wistar大鼠在禁食12 h后,采用鏈脲佐菌素尾靜脈注射60 mg/kg建立大鼠糖尿病模型。72 h 后采用血糖儀試紙法檢測(cè)血糖值，其中空腹血糖值≥15 mmol/L大鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠。

2.2 分組與治療

實(shí)驗(yàn)分為5組，每組18只，雌雄各半。每組給藥劑量按每日成人最大給藥劑量換算。芪蛭降糖片組(每日灌胃芪蛭降糖片混懸液780 mg/kg)；鹽酸二甲雙胍片組(每日灌胃鹽酸二甲雙胍片混懸液200 mg/kg)；格列本脲片組(每日灌胃格列本脲片混懸液1.5 mg/kg)；模型組和正常組作為對(duì)照。連續(xù)給藥3 mon。

2.3 治療評(píng)價(jià)

觀察每組大鼠的一般狀況，如毛色、生理狀態(tài)、活動(dòng)頻率等。每周稱量各組大鼠體重及檢測(cè)各組大鼠24 h排尿量、飲食量、飲水量。治療后第20天、第50天、第90天測(cè)空腹血糖值；眼眶靜脈叢采血，靜止離心分離血清，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清INS、 GSP及iNOS。3 mon后處理大鼠，取胰腺多聚甲醛固定，按本課題組以前的方法[7]進(jìn)行HE染色，評(píng)價(jià)胰腺損傷情況。

2.4 芪蛭降糖片活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過研究發(fā)現(xiàn)，芪蛭降糖片由黃芪、黃精、地黃和水蛭組成。以“黃芪”“黃精”“地黃”為關(guān)鍵詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái) TCMSP中查找其主要化學(xué)成分，通過評(píng)價(jià)成分的體內(nèi)過程，用口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18 篩選黃芪、黃精、地黃的活性成分。通過文獻(xiàn)檢索得到水蛭中的化學(xué)成分[8]。將芪蛭降糖片中篩選得到的活性成分作為關(guān)鍵詞在 Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索, 下載 SDF 格式有效成分的 3D 結(jié)構(gòu), 再將各活性成分的 3D 結(jié)構(gòu)式提交到 PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行芪蛭降糖片靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2.5 篩選芪蛭降糖片對(duì)胰島損傷相關(guān)治療靶點(diǎn)

采用TTD和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)以“diabetes”為關(guān)鍵詞收集與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)的疾病靶點(diǎn)。為明確糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)與藥物芪蛭降糖片潛在靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將糖尿病明確疾病靶點(diǎn)與芪蛭降糖片靶點(diǎn)輸入 Venny 2.1韋恩圖在線繪制工具取交集繪制。篩選出與芪蛭降糖片治療糖尿病胰島損傷作用明確相關(guān)的治療靶點(diǎn)。

2.6 富集生物過程和KEGG通路分析

將篩選出的糖尿病治療靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集生物過程和KEGG通路富集分析，以P<0.05，count>4篩選出對(duì)應(yīng)相關(guān)的生物過程和信號(hào)通路。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 芪蛭降糖片對(duì)糖尿病大鼠一般癥狀的影響

多飲、多食、多尿、體重減輕是糖尿病的典型癥狀，模型組上述癥狀表現(xiàn)很明顯并且出現(xiàn)腹部膨大現(xiàn)象。采用芪蛭降糖片、鹽酸二甲雙胍片和格列本脲片進(jìn)行治療后上述癥狀較模型組有所改善，但兩種常用西藥對(duì)腹部膨大改善不明顯，而芪蛭降糖片可以減小腹部膨大，具有較好的療效。見表1、表2、表3。

表1 大鼠飲水量和食量

表2 大鼠尿量和體重

表3 大鼠腹圍

3.2 芪蛭降糖片對(duì)糖尿病大鼠血糖和血清INS、GSP及iNOS的影響

模型組大鼠血糖升高，血清INS降低，GSP和iNOS增高。與模型組相比，給藥組能夠降低糖尿病大鼠的高血糖。芪蛭降糖片降糖作用雖不及鹽酸二甲雙胍片和格列本脲片起效快，但能明顯改善低胰島素和高GSP及iNOS狀態(tài)，見表4。

表4 大鼠血清GSP及iNOS

3.3 芪蛭降糖片對(duì)糖尿病大鼠胰腺的保護(hù)作用

對(duì)各組大鼠胰腺切片HE染色發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠胰島細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞水腫變形，表現(xiàn)出胰腺組織損傷明顯；鹽酸二甲雙胍片組和格列本脲片組胰腺組織損傷改善不明顯；芪蛭降糖片組可見胰腺組織損傷明顯改善。見圖1。

圖1 胰腺組織病理變化

3.4 芪蛭降糖片活性成分及作用靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)查找OB≥30%和DL≥0.18篩選芪蛭降糖片18個(gè)主要活性成分及521個(gè)作用靶點(diǎn)。通過與TTD和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)糖尿病相關(guān)治療靶點(diǎn)比對(duì)分析得到30個(gè)芪蛭降糖片治療糖尿病胰島損傷作用明確相關(guān)的治療靶點(diǎn)。采用 Cytoscape 3．2．1 軟件繪制芪蛭降糖片靶點(diǎn)—成分網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

3.5 芪蛭降糖片富集生物過程和通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)將上述30個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集生物過程和KEGG通路富集分析，得到20個(gè)生物過程和17條相關(guān)通路。其中生物過程涉及“炎癥反應(yīng)”“調(diào)節(jié)胰島素分泌” “一氧化氮生物合成過程的正調(diào)節(jié)”“細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)”等，見表6。 KEGG信號(hào)通路涉及“PI3K-Akt信號(hào)通路”“胰島素信號(hào)通路”“胰島素抵抗”“Jak-STAT信號(hào)通路”等，見表7。

圖2 芪蛭降糖片活性成分-作用靶點(diǎn)圖

表6 GO富集分析

表7 KEGG通路分析

4 討論

糖尿病是一種機(jī)體機(jī)能紊亂性疾病，其典型特征為慢性持續(xù)性的血糖增高、糖耐量異常以及尿糖陽(yáng)性。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，主要病機(jī)為氣陰兩虧、燥熱內(nèi)盛[9-10]。芪蛭降糖片由黃芪、水蛭、地黃和黃精組成，其中黃芪為補(bǔ)氣之最，地黃和黃精長(zhǎng)于滋陰清熱，水蛭最擅消除氣陰兩虧和燥熱內(nèi)盛引起的血瘀，四者合用發(fā)揮著治療糖尿病的作用。在本研究過程中，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)高血糖及“三多一少”癥狀。常用口服降糖藥與芪蛭降糖片均能降低血糖，改善癥狀，但其速度和機(jī)制卻不同。

胰島β細(xì)胞分泌胰島素或胰島素在機(jī)體內(nèi)的利用過程發(fā)生障礙是糖尿病患者血糖增高的主要原因。因此，以往糖尿病的治療總是以補(bǔ)充胰島素、促進(jìn)胰島素分泌和提高胰島素的敏感性為主。在糖尿病患者中胰島炎癥損傷引起廣泛的關(guān)注，越來越多的人開始關(guān)注促進(jìn)胰島損傷修復(fù)作為治療糖尿病的新途徑。本研究建立的糖尿病模型大鼠血清GSP及iNOS增高，提示存在持續(xù)炎癥損傷。病理切片顯示，胰腺組織損傷明顯。血清INS持續(xù)降低證實(shí)了胰島損害。與常用口服降糖藥相比，芪蛭降糖片雖降糖速度較慢，但能修復(fù)胰島損傷，有阻止胰島細(xì)胞纖維化、炎癥和凋亡作用。并且可以降低血清GSP及iNOS含量。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過系統(tǒng)方法分析藥物對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的作用和影響，從整體角度認(rèn)識(shí)和預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)的方法，適用于解釋中藥單復(fù)方復(fù)雜成分的作用機(jī)制[11-13]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,通過分析芪蛭降糖片的主要活性成分和治療糖尿病胰島損傷的相關(guān)靶點(diǎn)，并預(yù)測(cè)了相關(guān)生物過程和信號(hào)通路，闡明芪蛭降糖片保護(hù)糖尿病胰島損傷的作用機(jī)制。在本研究中發(fā)現(xiàn)了芪蛭降糖片保護(hù)糖尿病胰島損傷涉及生物過程20個(gè)，富集在17條信號(hào)通路上。生物過程涉及炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)胰島素分泌、 細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等。這些表明上述的生物過程在糖尿病發(fā)病中起重要作用。KEGG信號(hào)通路涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路等。研究表明[14]PI3K-AKT 信號(hào)通路可以調(diào)控相關(guān)因子蛋白的表達(dá)，激活胰腺 PI3K-AKT 信號(hào)通路，減輕胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞的損傷從而保護(hù)胰島β細(xì)胞，從而改善胰島素抵抗，降低血糖。因此PI3K-AKT 信號(hào)通路對(duì)胰島 β細(xì)胞分泌胰島素具有重要作用。然而其他方面芪蛭降糖片的生物過程和信號(hào)通路需要進(jìn)一步探索研究。

綜上所述，相較于常用西藥，芪蛭降糖片通過多途徑、多靶點(diǎn)參與促進(jìn)胰腺損傷修復(fù)，長(zhǎng)期服用有促進(jìn)胰島功能恢復(fù)正常作用，可用于防治糖尿病及相關(guān)血管并發(fā)癥。