肖曉霞 陳暢 夏寶妹 陶偉偉

南京中醫(yī)藥大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（南京210023）；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院（南京210001）；3南京特殊教育師范學(xué)院康復(fù)科學(xué)學(xué)院（南京210023）

產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression，PPD）是分娩最常見和致殘的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在高收入國家為6.9%～12.9%，低中等收入國家達(dá)到20%以上［1］。約20%的患者出現(xiàn)自殺念頭，其引起的產(chǎn)婦自殺是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因［1-2］，給產(chǎn)婦、家庭及社會帶來嚴(yán)重危害。因此，研究PPD 的發(fā)病機(jī)制以及藥物防治具有重要的臨床意義。

哺乳動物sirtuins（SIRT1-7）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴性脫酰酶，參與衰老、炎癥、能量代謝、細(xì)胞分化、應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)［3-4］。sirtuins具有不同的亞細(xì)胞定位和酶活性。其中，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表現(xiàn)出NAD 依賴性脫乙酰酶活性，可使多種底物去乙?；Ｑ芯浚?-7］表明SIRT1 在抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但其在PPD 的發(fā)病機(jī)制中鮮有研究。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）—核糖體S6 蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）—轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）信號通路是將細(xì)胞外刺激信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，其在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性疾病中被廣泛研究。研究［8］發(fā)現(xiàn)ERK信號參與了SIRT1 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，兩者協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但在PPD 中ERK 信號是否參與了SIRT1 介導(dǎo)的抗抑郁作用，尚未見到相關(guān)報(bào)道。

氟西汀、丙咪嗪等傳統(tǒng)抗抑郁藥會導(dǎo)致患者出現(xiàn)頭痛、惡心、口干等不良反應(yīng)［9］，且治療周期長、費(fèi)用高，臨床上患者治愈率往往不高。與西藥治療相比，中藥具有整體調(diào)節(jié)、副作用小、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，近年來已成為PPD 新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。其中，越鞠甘麥大棗湯由“統(tǒng)治六郁”的越鞠丸合甘麥大棗湯劃裁而來，在實(shí)踐中療效確鑿［10］，但其相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建PPD 動物模型的基礎(chǔ)上，以SIRT1-ERK1/2 信號通路為切入點(diǎn)，探討在PPD 模型中是否存在該信號通路的異常，以及越鞠甘麥大棗湯能否通過該通路發(fā)揮抗抑郁作用，以期為PPD 的臨床治療提供新思路和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物Balb/c 雌性小鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購買于青龍山動物中心，動物合格證：SCXK（蘇）2016-0010。

1.2 藥物及試劑實(shí)驗(yàn)藥材購自南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診。越鞠甘麥大棗湯組方：神曲100 g、香附100 g、梔子100 g、淮小麥250 g、蒼術(shù)100 g、川芎100 g、大棗375 g、炙甘草125 g。上述藥物加8 倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，收集藥液，加6 倍量水2 次煎煮，合并兩次藥液，65 ℃旋蒸濃縮至藥物終濃度為8.3 g/kg；艾司西酞普蘭（美侖，批號：MB1290）；抗體：SIRT1（Affinity，貨號：DF6033）、ERK（CST，貨號：9102）、P-ERK（CST，貨號：4376）、P90RSK（Affnity，貨號：AF4777）、CREB（proteintech，貨號：12208-1-AP）、GAPDH（proteintech，貨號：60004-1-Ig）；蛋白Marker（良緯科技，貨號：Y007）；ECL 發(fā)光液（Affinity，貨號：KF001）。

1.3 主要儀器動物行為分析系統(tǒng)（Any-maze，USA）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，USA）；凝膠成像及分析系統(tǒng)（Tannon-5200，上海天能）。

1.4 模型制備及越鞠甘麥大棗湯給藥40 只雌性Balb/c 小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、艾司西酞普蘭組和越鞠甘麥大棗湯組，每組10 只。除對照組，應(yīng)激母鼠每天給予束縛刺激6 h（11：00～17：00）聯(lián)合每周2 次24 h 光照刺激。應(yīng)激6 周后，對照組和應(yīng)激小鼠均與正常雄性Balb/c 小鼠合籠交配。小鼠分娩3 周后，對照組和模型組按10 mL/（kg·d）劑量生理鹽水灌胃，艾司西酞普蘭組按20 mg/（kg·d）劑量腹腔注射，越鞠甘麥大棗湯組按8.3 g/（kg·d）劑量灌胃，給藥2 周，進(jìn)行糖水偏好和強(qiáng)迫游泳測試，以小鼠糖水偏好降低和強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加為判斷造模成功的主要依據(jù)。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 糖水偏好測試造模前，每只小鼠給予兩瓶2% 蔗糖溶液適應(yīng)3 d。測試前24 h，小鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水，每只小鼠給予2%蔗糖溶液和純水各1 瓶，1 h 后交換蔗糖溶液和純水瓶的位置，記錄小鼠2 h 內(nèi)蔗糖溶液和純水的消耗量。蔗糖消耗百分比計(jì)算公式為：蔗糖消耗%=［（蔗糖消耗量）/（蔗糖消耗量+純水消耗量）］×100%。

1.5.2 強(qiáng)迫游泳測試將小鼠置于水深約為15 cm的圓柱體玻璃容器（直徑18 cm，高25 cm）中，調(diào)整水溫為24～26 ℃，每只小鼠共游泳6 min。Anymaze 軟件記錄小鼠活動，并分析最后4 min 的不動時(shí)間。

1.5.3 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平小鼠處死后在冰上取出海馬組織，提取蛋白并測定濃度。10% SDS-PAGE 膠上樣，電泳分離，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別用SIRT1、ERK1/2、P-ERK1/2、P90RSK、CREB 一抗孵育，4 ℃過夜。TBST 漂洗3 × 10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST 漂洗3 × 10 min。暗室中ECL 發(fā)光液顯影，采集各條帶及其內(nèi)參的灰度值，得到各樣本蛋白的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)均用（）表示，應(yīng)用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)分析軟件對多組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Post Hoc Test 選用LSD 方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 越鞠甘麥大棗湯對PPD 小鼠抑郁樣行為的影響

2.1.1 越鞠甘麥大棗湯增加PPD 小鼠糖水偏好

與對照組（Con）相比，模型組（Mod）小鼠的糖水偏好下降（P＜0.05）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯（YG）和艾司西酞普蘭（Es）給藥均能明顯增加小鼠的糖水偏好（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠的糖水偏好Fig.1 The sucrose preference of mice in each group

2.1.2 越鞠甘麥大棗湯減少PPD 小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間與對照組相比，模型組小鼠強(qiáng)迫游泳測試的不動時(shí)間增加（P＜0.01）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭給藥均能降低小鼠的不動時(shí)間（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間Fig.2 Immobility time of mice in each group in forced swimming test

2.1.3 越鞠甘麥大棗湯增加PPD小鼠體質(zhì)量與對照組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量減少（P＜0.05）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭均能增加小鼠的體質(zhì)量（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠的體質(zhì)量Fig.3 The body weight of mice in each group

2.2 越鞠甘麥大棗湯對PPD 小鼠海馬SIRT1-ERK1/2 信號相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，模型組小鼠海馬中SIRT1（圖4A）、P-ERK1/2（圖4B）、P90RSK（圖4C）及CREB（圖4D）的表達(dá)均降低（P＜0.05），ERK 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），P-ERK/ERK 降低（P＜0.05）。與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯增加小鼠海馬SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK 及CERB 的表達(dá)（P＜0.05），與艾司西酞普蘭作用相似（P＜0.05）。

3 討論

研究表明，情緒和焦慮病史是導(dǎo)致母親產(chǎn)后出現(xiàn)抑郁癥狀的高危因素［1］，抑郁動物表現(xiàn)出自發(fā)活動總路程減少、糖水偏好降低、強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加等抑郁行為［11-12］。其中，反應(yīng)快感缺失的糖水偏好降低和反應(yīng)行為絕望的強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加是抑郁動物的核心癥狀。本研究選取了糖水偏好測試和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)作為判斷造模成功與否的主要依據(jù)，并根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)建立產(chǎn)前應(yīng)激誘導(dǎo)的PPD 模型［13］。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠表現(xiàn)出糖水偏好降低，強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加，體質(zhì)量減少等抑郁樣行為，提示造模成功。越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭給藥均能增加小鼠糖水偏好，降低小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間并增加小鼠的體質(zhì)量，表明越鞠甘麥大棗湯與艾司西酞普蘭均表現(xiàn)出抗抑郁治療作用。

圖4 各組小鼠海馬中SIRT1-ERK1/2 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression level of SIRT1-ERK1/2 signaling pathway related proteins in the hippocampus of mice in each group

SIRT1 最初被鑒定為組蛋白脫乙酰基酶，在海馬、丘腦、小腦和大腦皮層中高表達(dá)［14］。SIRT1 參與神經(jīng)元存活的調(diào)節(jié)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。在神經(jīng)生長過程中，SIRT1 參與神經(jīng)元軸突生長、樹突分枝［6，15］，并調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性和突觸形成［16］。有研究認(rèn)為，SIRT1 的抑制參與了抑郁癥的發(fā)病過程。LIU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激降低雄性C57BL/6 小鼠海馬SIRT1mRNA 的表達(dá)水平。LEI 等［18］發(fā)現(xiàn)SIRT1 內(nèi)側(cè)前額葉皮層特異性敲除誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，而SIRT1 激活劑SRT2104 可逆轉(zhuǎn)小鼠的快感缺失和行為絕望。

目前研究［19］認(rèn)為，ERK 途徑參與了SIRT1 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。ERK 作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，參與神經(jīng)元存活和神經(jīng)保護(hù)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［8，20］。SIRT1 激活增強(qiáng)ERK 活化，協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［21］。此外，ERK 信號激活后作用于其直接底物RSK，兩者協(xié)同作用共同入核，促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子CREB 活化以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與多種生物學(xué)效應(yīng)的形成過程［22-23］。不同造模方式誘導(dǎo)的抑郁動物模型中，ERK1/2-CREB 信號顯著下調(diào)，而抗抑郁藥可激活ERK1/2-CREB 信號通路，增加磷酸化ERK1/2的表達(dá)水平［24-26］。在本研究中，PPD模型組小鼠海馬SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK、CREB 等蛋白的表達(dá)均明顯降低，而越鞠甘麥大棗湯給藥能顯著上調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示孕前慢性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁癥狀，其發(fā)病機(jī)制可能與小鼠海馬SIRT1-ERK1/2 信號系統(tǒng)被抑制有關(guān)，中藥可能通過激活SIRT1-ERK1/2 信號通路，增強(qiáng)神經(jīng)元存活能力，提高神經(jīng)保護(hù)作用及改善神經(jīng)可塑性從而產(chǎn)生抗抑郁作用。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺再攝取抑制劑西酞普蘭可上調(diào)人神經(jīng)祖細(xì)胞SIRT1 表達(dá)，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西酞普蘭可逆轉(zhuǎn)重度抑郁癥患者血液樣本中SIRT1 mRAN 的表達(dá)降低［27］。在本研究中，艾司西酞普蘭表現(xiàn)出相似的上調(diào)SIRT1 等蛋白表達(dá)的作用。然而臨床上艾司西酞普蘭治療的患者易出現(xiàn)腹瀉、失眠等不良反應(yīng)［28］，而中藥在臨床治療中副作用少，安全性高，或許能為PPD 的藥物研發(fā)提供新的選擇和方向。

綜上所述，本研究表明越鞠甘麥大棗湯能改善PPD 小鼠的抑郁樣行為，且其可能是通過激活海馬SIRT1-ERK1/2 信號發(fā)揮作用的。本研究首次提出SIRT1 參與了PPD 的發(fā)病過程且中藥可通過影響相關(guān)蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗抑郁作用，為臨床防治PPD 提供了新的研究思路。但本實(shí)驗(yàn)只是初步探討了越鞠甘麥大棗湯影響小鼠海馬相關(guān)蛋白的表達(dá)，未對其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。在接下來的研究中，將采用SIRT1 基因敲除和過表達(dá)或使用相應(yīng)拮抗劑的方式來研究SIRT1在PPD 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用以及藥物的治療機(jī)制。