劉偉治，滕潞瑤，張小康，王露露

( 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

藤壺(Balanus)是世界沿海港口和海灣的主要污損生物，分布范圍涵蓋了潮間帶至潮下帶，通過分泌粘性極強(qiáng)、可在水下交聯(lián)聚合的膠粘物，牢固地附著在水下物體表面[1]。藤壺膠由分泌腺合成并分泌，通過導(dǎo)管系統(tǒng)輸送至附著界面，6 h內(nèi)聚合成不透明的膠塊，其蛋白含量超過90%[2]。研究發(fā)現(xiàn)在藤壺的粘附膠固化過程中酶的作用十分關(guān)鍵，Cheung[3]等早在四十多年前就發(fā)現(xiàn)藤壺膠生物合成需要賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase，LOX)參與。LOX在哺乳動物體內(nèi)可催化膠原蛋白和彈性蛋白中賴氨酸和羥賴氨酸的交聯(lián)，增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性[4-6]。Christopher等通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在藤壺膠中發(fā)現(xiàn)了幾種一級結(jié)構(gòu)由富含Gly/Ser/Thr/Ala的低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域和富含Lys和Arg的復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域交替組成的蛋白，這與膠原蛋白和彈性蛋白序列具有相似性，且賴氨酸含量超過10%，可作為交聯(lián)位點(diǎn)[7]，推測交聯(lián)可以改變粘附蛋白的物理狀態(tài)和性能[8]。而且進(jìn)一步研究證實(shí)在藤壺膠中存在LOX活性，且在藤壺中發(fā)現(xiàn)了與果蠅LOX具有同源性的蛋白序列[9-10]。但因藤壺膠極易固化，造成了LOX提取困難；所以研究人員一直希望通過基因工程實(shí)現(xiàn)有活性的藤壺LOX重組制備。但迄今為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，說明LOX在原核生物中重組表達(dá)難度較大[11-12]，已成為藤壺膠形成機(jī)制研究的瓶頸。

此前基于多組學(xué)技術(shù)在藤壺膠內(nèi)鑒定到了與人LOX家族成員序列具相似性的蛋白[19-23]，命名為BalLOX。為獲得有活性的BalLOX，本研究通過對BalLOX表達(dá)序列的長度和表達(dá)載體進(jìn)行篩選，首次獲得了重組BalLOX的可溶性表達(dá)，為后續(xù)藤壺粘附膠組成機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pMCSG 9 表達(dá)載體質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌 BL21 (DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存；所有引物合成及 Sanger 測序委托生工生物工程股份有限公司； PrimeSTAR ? GXL DNA Polymerase、EcoRI和NotI內(nèi)切酶、T4連接酶購買于 Takara；辣根過氧化物酶和各種生化試劑購買自BBI；3-氨基丙腈(β-BAPN，Alfar Aesar)、1,5-二氨基戊烷和各種常規(guī)化學(xué)試劑購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； Amplex Red(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 BalLOX氨基酸序列分析 通過SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)對蛋白的全長氨基酸序列進(jìn)行信號肽及功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，再通過NCBI在線BLAST(Basic Lacol Alignment Search Tool)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中尋找與BalLOX催化區(qū)域序列相似性較高的蛋白，利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對分析。

1.2.2 BalLOX重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)BalLOX的全長基因序列，設(shè)計(jì)并合成PCR引物。分別設(shè)計(jì)只含催化區(qū)域(命名為BalLOX_CD)以及含1個(gè)/2個(gè)富含半胱氨酸的清道夫受體(Scavenger receptor cysteine-rich domain，SRCR)結(jié)構(gòu)域和催化區(qū)域的亞克隆(分別命名為BalLOX_CD+1 SRCR和 BalLOX_CD+2 SRCR)，引物序列如表1，5’端具有EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端具有NotI酶切位點(diǎn)，以BalLOX的全長基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增基因序列。將PCR擴(kuò)增的DNA片段凝膠回收，分別連接至pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pMCSG9載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，對所有重組表達(dá)載體進(jìn)行測序。

表1 PCR引物列表

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)和優(yōu)化 將含目的序列的單克隆菌株以1%的接種量接種于1 L含有卡那(Kan)/氨芐霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌體生長達(dá)到對數(shù)生長期(OD600≈0.8)。加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，37 ℃/16 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，加入20 mmol/L Tris-HCl pH=8.0/500 mmol/L NaCl緩沖液重懸超聲破碎菌體，離心留取上清溶液作為粗酶。

1.2.4 BalLOX_CD酶活檢測 由于LOX是一種銅依賴性的胺氧化酶，銅是LOX的重要輔基，只有與銅結(jié)合酶才具有活性[15-16]。所以將BalLOX_CD粗酶于20 mmol/L Tris-HCl pH=8.0、1 mmol/L CuSO4透析外液中4 ℃下透析3 h，利用考馬斯亮藍(lán)法檢測粗酶溶液中全蛋白濃度。為了排除MBP標(biāo)簽對酶活的影響，添加同樣方法處理得到的MBP標(biāo)簽蛋白組和不加酶組作為空白對照。

根據(jù)Palamakumbura等描述的 Amplex red熒光法[17]檢測酶活，以β-BAPN孵育后的酶作為陰性對照，檢測反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度變化。Δ熒光強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組(反應(yīng)前-反應(yīng)后)-β-BAPN對照組(反應(yīng)前-反應(yīng)后)。一個(gè)單位的胺氧化酶活性定義為在37 ℃下每分鐘氧化1 μmol/L 1,5-二氨基戊烷底物的活性，底物的反應(yīng)濃度由H2O2生成濃度確定[18]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2生成濃度，因此單位酶活計(jì)算公式為：單位酶活(U/mg)=H2O2生成濃度(μmol/L)/加酶量(mg)/ 反應(yīng)時(shí)間(min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 BalLOX氨基酸序列分析 BalLOX全長517個(gè)氨基酸，前18個(gè)氨基酸為信號肽序列，76～182和207～297處的氨基酸序列為兩個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域，305～517處的氨基酸序列為LOX催化結(jié)構(gòu)域(見圖1)。將BalLOX的催化區(qū)域氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對分析，BalLOX_CD與人LOX家族5個(gè)成員的蛋白序列催化區(qū)域有35%～42%的相似性[19-23]，且與催化區(qū)域中的兩個(gè)保守區(qū)域氨基酸都具有一致性(見圖2)，第一個(gè)區(qū)域?yàn)殂~結(jié)合部位，含有四個(gè)組氨酸；第二個(gè)區(qū)域位于C 末端，含有高度保守的酪氨酸殘基，為催化區(qū)域，可以與賴氨酸殘基一起參與形成賴氨酰酪氨基醌( lysine tyrosyl quinone, LTQ)，因此推測BalLOX_CD可能具有LOX的活性。

圖1 BalLOX結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 The domain of BalLOX

(4 His和LTQ為文中所述LOX家族成員中兩個(gè)高度保守的區(qū)域。4 His and LTQ are two highly conserved Domain in the LOX family. GenBank ID：lysyl oxidase [AAB23549.1]，Lysyl oxidase-like 1 [AAH68542.1]，Lysyl oxidase-like 2 [AAH00594.1]，lysyl oxidase-like 3 protein [AAK63205.1]，lysyl oxidase-like 4 [AAL27543.1])

2.1.2 BalLOX 基因片段的克隆 考慮到SRCR結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸(每個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域含6個(gè)Cys)，可能會發(fā)生交聯(lián)降低蛋白的溶解度，因此設(shè)計(jì)了不同長度的亞克隆(分別命名為BalLOX_CD+2 SRCR、 BalLOX_CD+1 SRCR和BalLOX_CD)，研究是否會對蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。PCR擴(kuò)增出3個(gè)基因片段(見圖3)。

(泳道：1和2顯示BalLOX_CD+1 SRCR基因片段條帶；3和4顯示BalLOX_CD基因片段條帶；5和6顯示BalLOX_CD+2 SRCR基因片段條帶。Lane M: DL 2000 DNA Maker. Lane 1&2: The target bands of BalLOX_CD+1 SRCR gene fragments; Lane 3&4: The target bands of BalLOX_CD gene fragments; Lane 5&6: The target bands of BalLOX_CD+2 SRCR gene fragments.)

2.1.3 高效 BalLOX表達(dá)體系的構(gòu)建和篩選

2.1.3.1 不同的重組表達(dá)標(biāo)簽對不同長度BalLOX 表達(dá)的影響 考慮到不同的表達(dá)標(biāo)簽蛋白會對重組蛋白的折疊和溶解性有重要影響。本研究選擇了pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pMCSG9這4種不同系統(tǒng)，分別對應(yīng)了4種不同的可溶性標(biāo)簽： His標(biāo)簽、Trx(硫氧還蛋白)標(biāo)簽、GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽和MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽，連接至亞克隆蛋白序列的N末端，來研究不同標(biāo)簽對蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)對比了不同誘導(dǎo)溫度(37和16 ℃)對重組蛋白表達(dá)的影響(見圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶SRCR結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)亞克隆連接pET-32a、pGEX-6p-1、pMCSG9載體后均不能在37 ℃表達(dá)，且連接pET-28a載體后于16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白均出現(xiàn)在菌體超聲破碎離心后的沉淀中(見圖5)，說明SRCR區(qū)對BalLOX的體外重組表達(dá)有較大影響；單獨(dú)的BalLOX_CD在兩個(gè)誘導(dǎo)溫度下均能表達(dá)，考慮到本研究以獲得高活性的酶為目的，因而選擇BalLOX_CD進(jìn)行后續(xù)研究。

(上圖中的SDS-PAGE電泳蛋白樣品均為未超聲裂解的全菌。泳道：M為Marker；0 為未誘導(dǎo)菌液；1為37 ℃下誘導(dǎo)；2為16 ℃下誘導(dǎo)。箭頭處為目的蛋白條帶。圖A和B分別為BalLOX_CD+2 SRCR和BalLOX_CD+1 SRCR連接如圖上標(biāo)注的4個(gè)載體后在37和16 ℃誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。連接pET-28a載體后蛋白于兩個(gè)誘導(dǎo)溫度下均表達(dá)，連接其他3個(gè)載體后僅16 ℃誘導(dǎo)下表達(dá)。圖C為BalLOX_CD連接如圖上標(biāo)注的4個(gè)載體后在37 和16 ℃誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。連接pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pMCSG9載體后蛋白于兩個(gè)誘導(dǎo)溫度下均能表達(dá)。The SDS-PAGE electrophoresis protein samples are whole bacterial without ultrasonication. M: Marker; 0: Uninduced bacterial solution; 1: Induction temperature is 37 ℃; 2: Induction temperature is 16 ℃. The arrows point to the band of target proteins. Figure A and B show the expressions of BalLOX_CD + 2 SRCR and BalLOX_CD + 1 SRCR with the four vectors marked on the figures were induced by 37 and 16 ℃. The proteins with pET-28a vector were expressed at two induction temperatures, and with the other three vectors were expressed only at 16 ℃. Figure C shows the expression of BalLOX_CD with the four vectors marked on the figure under the induction of 37 and 16 ℃. The proteins with pET-28a, pET-32a, pGEX-6p-1, and pMCSG9 vectors were expressed at both induction temperatures.)

(泳道M為Marker；1為菌體超聲破碎離心后上清溶液；2為離心后沉淀。箭頭處為目的蛋白條帶。M：Marker；1：Supernatant after ultrasonication and centrifugation of E.coli BL21; 2. Precipitate. The arrows point to the band of target proteins.)

2.1.3.2 BalLOX_CD 可溶性表達(dá)載體的篩選 考慮到通常情況下低溫可以減緩菌體生長和蛋白表達(dá)及折疊速度，降低錯誤折疊形成包涵體的概率，從而提高外源蛋白表達(dá)的可溶性[24-26]。因此選擇在誘導(dǎo)溫度為16 ℃的條件下，篩選能夠?qū)崿F(xiàn)BalLOX_CD可溶性表達(dá)的標(biāo)簽。除了pMCSG9-BalLOX_CD外，其它表達(dá)系統(tǒng)中獲得的重組蛋白均出現(xiàn)在菌體超聲破碎離心后的沉淀中，說明其以包涵體的形式存在(見圖6)。因此最終選擇攜帶MBP標(biāo)簽的BalLOX_CD蛋白用于后續(xù)酶活性的檢測。

2.1.4 酶活測定 BalLOX_CD在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)后，在含Cu2+的Tris-HCl透析外液中透析后可獲得純度較高的BalLOX_CD蛋白樣品(見圖7a)。向反應(yīng)體系中分別加入1 μg 酶和MBP蛋白，檢測反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度變化(見圖7b)。在此測活條件下根據(jù)單位酶活計(jì)算公式計(jì)算得到MBP標(biāo)簽單位質(zhì)量酶活為約0.018 U/mg，而攜帶MBP標(biāo)簽的BalLOX_CD的單位質(zhì)量酶活為(0.119± 0.012)U/mg。

(a. 為MBP和BalLOX_CD蛋白透析后SDS-PAGE電泳圖。b. 不同酶濃度下反應(yīng)結(jié)束后熒光強(qiáng)度變化。a. The recombinant expression of MBP and BalLOX_CD. b. Changes in fluorescence intensity at the end of the reaction at different enzyme concentrations. The fluorescence intensity in the figure is the value obtained by subtracting the β-BAPN negative control.)

2.2 討論

目前，對于藤壺水下粘附機(jī)制及藤壺膠的固化機(jī)制仍未明確。Christopher等首次通過質(zhì)譜在網(wǎng)紋藤壺膠中鑒定到了賴氨酰氧化酶AaLOX(KY762300)，還檢測到醛/酮以及LOX活性的存在，推測LOX在藤壺膠中發(fā)揮的作用與在彈性蛋白中類似[9-10]，因此LOX在藤壺成膠粘附過程中發(fā)揮著重要作用。但由于藤壺來源的LOX蛋白序列，與哺乳動物的LOX同源性較低，如與人成熟的LOX(從Asp 169開始)序列(GenBank Accession No. M94054)同源性為21%[14]，與人成熟的LOXL(從Asp 135開始)序列(GenBank Accession No. L21186)同源性為26%[11-14]，因此，LOX在藤壺中的作用機(jī)制并不能完全用在哺乳動物體內(nèi)的催化機(jī)制來解釋，還需要進(jìn)一步研究闡明。所以迫切需要對藤壺LOX進(jìn)行重組表達(dá)和活性研究，但之前文獻(xiàn)報(bào)道提示藤壺LOX在原核表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)困難。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)即使是人LOX在體外表達(dá)的過程中也易發(fā)生沉淀和聚集，主要以包涵體的形式存在，需要重折疊以獲得活性酶，這個(gè)過程不僅耗時(shí)且易導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量和酶活性的損失，因此通過體外重組表達(dá)的方式，得到具有活性的LOX具有一定難度[11-12]。本研究首次將藤壺賴氨酰氧化酶BalLOX進(jìn)行了重組表達(dá)，通過基因長度，表達(dá)載體和表達(dá)條件的篩選，最終獲得了可溶性表達(dá)的藤壺重組LOX催化區(qū)域亞克隆蛋白，產(chǎn)量能達(dá)到0.28 g/L培養(yǎng)基，且攜帶MBP標(biāo)簽的蛋白單位質(zhì)量酶活在0.119 U/mg左右。此前Smith等在人LOX上添加Nus-A標(biāo)簽后同樣獲得了可溶性蛋白，但最終酶產(chǎn)量僅0.75 mg /L培養(yǎng)基，攜帶Nus-A標(biāo)簽后單位質(zhì)量酶活性約0.11 U /mg[12]。相比之下，本研究獲得的BalLOX酶活性基本相同，但酶產(chǎn)量提高了373倍。

綜上所述，本研究首次成功表達(dá)了藤壺來源的具有催化活性的LOX，并實(shí)現(xiàn)了酶的高效可溶性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了藤壺LOX的體外高效重組表達(dá)，為后續(xù)藤壺膠的形成機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。