張曉華，鐘浩輝，陳吉祥

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237；3. 蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院, 甘肅 蘭州 730050)

活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state，VBNC)[1]是某些細(xì)菌的一種特殊存活形式，指某些細(xì)菌在不良環(huán)境中形成的一種休眠狀態(tài)，在常規(guī)培養(yǎng)條件下無(wú)法繁殖，但仍然保持代謝活性。VBNC狀態(tài)下細(xì)菌的形態(tài)、生理生化、遺傳特征等都會(huì)發(fā)生一系列變化，并且在適宜條件下則能夠被復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)[2-3]。VBNC狀態(tài)是中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院徐懷恕和美國(guó)馬里蘭大學(xué)的著名海洋微生物學(xué)家Rita R. Colwell等于1982年研究霍亂弧菌(Vibriocholerae)和大腸桿菌(Escherichiacoli)在海洋與河口環(huán)境的存活規(guī)律時(shí)首次報(bào)道的。該發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外引起了極大的反響，截至2020年3月，已有10 800余篇VBNC相關(guān)論文發(fā)表。

本文重點(diǎn)介紹VBNC細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、VBNC細(xì)菌的主要類群和誘導(dǎo)因素、VBNC細(xì)菌的形成機(jī)制、生物學(xué)特征、檢測(cè)和復(fù)蘇方法以及環(huán)境VBNC細(xì)菌的分離培養(yǎng)等。目前絕大多數(shù)海洋微生物尚未獲得純培養(yǎng)，期望通過(guò)對(duì)VBNC細(xì)菌的深入了解，探索海洋細(xì)菌培養(yǎng)的新方法，促進(jìn)海洋微生物新資源的開(kāi)發(fā)利用。

1 VBNC細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過(guò)程

1970年代，海洋微生物生態(tài)學(xué)研究中存在著一些令人困惑的問(wèn)題，其中包括霍亂弧菌(Vibriocholerae)和其他弧菌的“冬隱夏現(xiàn)”現(xiàn)象?；魜y弧菌是國(guó)際上廣為關(guān)注的病原菌，曾引發(fā)六次世界性霍亂病大流行，導(dǎo)致大批患者死亡。當(dāng)時(shí)的研究工作證明，霍亂弧菌是海洋與河口環(huán)境中天然微生物區(qū)系的成員，可在春夏秋季水溫較高時(shí)，以常規(guī)條件從水體、沉積物和浮游生物中分離培養(yǎng)出來(lái)，但在冬季水溫降到10 ℃以下時(shí)，以上環(huán)境中均不能分離培養(yǎng)得到霍亂弧菌，而待第二年水溫較高時(shí)霍亂弧菌又能再次被分離出來(lái)[4]。類似的“年循環(huán)”現(xiàn)象同樣也存在于副溶血弧菌(V.parahemolyticus)中。當(dāng)時(shí)，這些病原弧菌的“冬隱夏現(xiàn)”現(xiàn)象一直未得到合理的解釋，無(wú)法確定冬季的弧菌究竟是“死”還是“活”。另外，研究發(fā)現(xiàn)海洋環(huán)境中并非所有的細(xì)菌都能夠用人工培養(yǎng)的方法獲得純培養(yǎng)菌株，直接鏡檢計(jì)數(shù)法獲得的細(xì)菌數(shù)量往往比常規(guī)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法的結(jié)果高很多倍[5]，而導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因并不清楚。此外，人們還發(fā)現(xiàn)，盡管4 ℃保存是陸生細(xì)菌最常用的臨時(shí)保存手段，但許多海洋細(xì)菌在4 ℃中保存一周后就無(wú)法繼續(xù)傳代培養(yǎng)，因此海洋細(xì)菌的保存一直是海洋微生物學(xué)家面臨的重要難題。

針對(duì)以上科學(xué)問(wèn)題，徐懷恕在美國(guó)馬里蘭大學(xué)Rita R. Colwell實(shí)驗(yàn)室做訪問(wèn)學(xué)者期間，以霍亂弧菌和大腸桿菌為模式菌株，開(kāi)展了其在海洋與河口環(huán)境的存活規(guī)律研究[1]。徐懷恕等以美國(guó)東海岸中部切薩皮克灣(Chesapeake Bay)的陳化河口水或添加少量蛋白胨的人工海鹽溶液作為模擬水體，將霍亂弧菌和大腸桿菌接種到合適的液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集菌體后接種到滅菌模擬水體(最終含菌量約為1.0×105cells/mL)中，置于4～6 ℃ 靜置培養(yǎng)。通過(guò)定期取樣，以總菌計(jì)數(shù)法和可培養(yǎng)菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果顯示，盡管細(xì)菌總數(shù)未見(jiàn)明顯變化，但可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量卻迅速下降，培養(yǎng)約10 d后數(shù)量降至零，表明大部分細(xì)菌在此時(shí)進(jìn)入了不可培養(yǎng)的狀態(tài)[1]。

如何證明這些用常規(guī)方法不能培養(yǎng)的細(xì)菌仍然是活菌？采用的檢測(cè)方法是發(fā)現(xiàn)細(xì)菌VBNC狀態(tài)的關(guān)鍵。徐懷恕等采用了日本科學(xué)家Kazuhiro Kogure等[5]當(dāng)時(shí)新建立的活菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法(Direct viable count, DVC)進(jìn)行檢測(cè)，即向水樣中加入萘啶酮酸(Nalidixic acid；0.001%，w/v)和酵母膏(Yeast extract;0.025%, w/v)，37 ℃培養(yǎng)6～24 h后以吖啶橙直接鏡檢計(jì)數(shù)法(Acridine orange direct count，AODC)進(jìn)行計(jì)數(shù)。萘啶酮酸是DNA促旋酶的抑制劑，能抑制DNA的復(fù)制，但不影響RNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，使得處理后的細(xì)菌只能生長(zhǎng)卻無(wú)法分裂，而凡是能夠合成自身物質(zhì)并長(zhǎng)大的菌體都可被認(rèn)定為活菌。采用該方法發(fā)現(xiàn)模擬水體中的活菌數(shù)量一般只降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，表明大部分細(xì)菌是活菌，但卻進(jìn)入了非可培養(yǎng)狀態(tài)?；谝陨涎芯?，徐懷恕等最終提出了細(xì)菌VBNC狀態(tài)的概念[1]。

VBNC狀態(tài)是細(xì)菌在不利環(huán)境中的一種存活機(jī)制。當(dāng)處于不利環(huán)境時(shí)，細(xì)菌無(wú)法在培養(yǎng)基上正常地生長(zhǎng)并形成菌落，但其細(xì)胞仍能夠保持完整性，并且維持呼吸作用、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等生理過(guò)程，只不過(guò)其形態(tài)、細(xì)胞壁的組成會(huì)發(fā)生一系列改變[1,6]。

2 VBNC細(xì)菌的主要類群及其誘導(dǎo)因素

迄今已陸續(xù)報(bào)道80余種細(xì)菌能夠在不利環(huán)境條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)(見(jiàn)表1)。它們主要是一些微生物學(xué)家廣泛關(guān)注的類群，如人類或養(yǎng)殖生物病原菌、具有重要生態(tài)意義的細(xì)菌、飲食和發(fā)酵工業(yè)相關(guān)細(xì)菌等，其中大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，變形菌門(mén)γ-變形菌綱細(xì)菌最多(18屬48種)，包括約20種弧菌, 少數(shù)則屬于α-變形菌綱(4屬5種)、β-變形菌綱(4屬5種)、ε-變形菌綱(3屬5種)和擬桿菌門(mén)(1屬1種)。此外，已發(fā)現(xiàn)17種革蘭氏陽(yáng)性菌能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)，分別屬于厚壁菌門(mén)(7屬11種)和放線菌門(mén)(5屬6種)。VBNC細(xì)菌的種類多樣性和廣泛分布說(shuō)明進(jìn)入VBNC狀態(tài)是細(xì)菌抵抗不良環(huán)境的普遍機(jī)制。

表1 已報(bào)道可進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌種類(更新自O(shè)liver[7-8] 和Pinto等[9])

續(xù)表1

目前已知能誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的環(huán)境因素包括：高/低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、鹽度或滲透壓、射線、氧氣濃度、生物殺傷劑、干燥、pH的劇烈變化及其他環(huán)境因子等[2,6,9]。這些環(huán)境因素可以引起細(xì)菌一系列變化，包括細(xì)胞形態(tài)變化、主要大分子的密度及結(jié)構(gòu)變化及其在固體或液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力的改變等，這些變化可能最終導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[2]。

溫度是誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的最重要因素。在對(duì)溫度變化的反應(yīng)上，不同種類的細(xì)菌，甚至同種細(xì)菌的不同菌株，均可能不同。弧菌通常受低溫(4～6 ℃)影響明顯，而其他細(xì)菌(如空腸彎曲桿菌，Campylobacterjejuni)似乎對(duì)高溫(25～37 ℃)更加敏感[2,8]。需要注意的是，溫度脅迫常伴隨有寡營(yíng)養(yǎng)條件等其他不良環(huán)境條件的協(xié)同作用。

營(yíng)養(yǎng)缺乏是誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的另一重要因素。海水中有機(jī)物的含量很低，常處于寡營(yíng)養(yǎng)(1～15 mg C/L)狀態(tài)。寡營(yíng)養(yǎng)菌對(duì)底物的特異性要求不高，能在寡營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，并長(zhǎng)時(shí)間存活。然而，富營(yíng)養(yǎng)菌只有在富營(yíng)養(yǎng)條件下才能生長(zhǎng)，進(jìn)入VBNC狀態(tài)可增強(qiáng)其在寡營(yíng)養(yǎng)水體中的存活能力，因此弧菌、假單胞菌(Pseudomonas)等富營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌均可在饑餓狀態(tài)下進(jìn)入VBNC狀態(tài)[2,6]。

鹽度或滲透壓會(huì)對(duì)多數(shù)腸道菌的生存產(chǎn)生很大的影響，但對(duì)海洋或河口的土著細(xì)菌影響較小，滲透壓保護(hù)劑如甘油、甜菜堿、谷氨酸鉀和海藻糖等對(duì)海水中的大腸桿菌具有保護(hù)作用，而對(duì)霍亂弧菌的可培養(yǎng)能力沒(méi)有顯著影響[2,8]。光線對(duì)細(xì)菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)作用隨細(xì)菌種類而異，其對(duì)細(xì)菌可培養(yǎng)能力的影響可能由細(xì)胞光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫造成[2,6]。氧脅迫也可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。如空腸彎曲桿菌暴露在空氣中時(shí)會(huì)很快進(jìn)入休眠狀態(tài)，推測(cè)可能與其微好氧特性有關(guān)。生物殺傷劑如重金屬、消毒劑及食品保鮮劑等也可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[2,8]。

3 VBNC細(xì)菌的誘導(dǎo)機(jī)制

到目前為止，有關(guān)細(xì)菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)機(jī)制的報(bào)道仍較少。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2在誘導(dǎo)許多細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)的過(guò)氧化氫酶突變菌株更容易進(jìn)入VBNC狀態(tài)；而把即將進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌涂布于添加有過(guò)氧化氫酶的常規(guī)培養(yǎng)基上時(shí)，創(chuàng)傷弧菌的可培養(yǎng)性會(huì)大大增加，證明H2O2確實(shí)可以參與VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)；低溫可抑制過(guò)氧化氫酶的合成和活性，使細(xì)菌細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中的H2O2高度敏感，因此低溫培養(yǎng)可使細(xì)菌由于冷激反應(yīng)而進(jìn)入VBNC狀態(tài)[2,8]。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌VBNC狀態(tài)和饑餓狀態(tài)是兩種不同的應(yīng)答機(jī)制，因?yàn)閮烧叩陌麅?nèi)蛋白表達(dá)差異較大，但仍有共同之處，如鹵化呋喃等小分子物質(zhì)可能在細(xì)胞進(jìn)入VBNC過(guò)程中起到信號(hào)傳遞作用?；魜y弧菌在VBNC狀態(tài)下有多達(dá)100個(gè)基因的表達(dá)量上升為正常狀態(tài)的5倍以上，其中包括Fe3+ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、PolB、FliG和FlaC等蛋白的編碼基因[2,6]。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)RpoS、多磷酸鹽激酶1(PPK1)和EnvZ三種蛋白質(zhì)也與細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)機(jī)制密切相關(guān)。RpoS編碼基因的突變能夠使大腸桿菌和腸道沙門(mén)氏菌(Salmonellaenterica)更快地進(jìn)入VBNC狀態(tài)，并且大腸桿菌細(xì)胞在VBNC狀態(tài)的維持時(shí)間及復(fù)蘇能力均有所下降；PPK1能夠參與多磷酸合成而影響細(xì)胞的各種生理功能，在空腸彎曲桿菌中PPK1突變使細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的能力有所下降。EnvZ編碼基因的突變也使大腸桿菌無(wú)法進(jìn)入VBNC狀態(tài)[9]。

4 VBNC細(xì)菌的生物學(xué)特征

除了VBNC狀態(tài)之外，早期在細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的其他休眠體形式，主要包括芽孢(Endospore)和孢囊(Cyst)。芽孢是形成于芽孢桿菌屬(Bacillus)等少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌生長(zhǎng)后期細(xì)胞內(nèi)的球形或橢球形休眠體，對(duì)不良環(huán)境具有極強(qiáng)抗逆性[22]，而孢囊是固氮菌屬(Azotobacter)等少數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞外壁加厚并失水縮短而形成的球形休眠體。VBNC細(xì)菌與芽孢和孢囊均存在很大差異[6,9]。

旅游業(yè)往往以盈利為主要目的，對(duì)資源及環(huán)境以不計(jì)后果的開(kāi)發(fā)方式來(lái)謀取最大利潤(rùn)，而在可持續(xù)發(fā)展觀念中，資源、環(huán)境、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)協(xié)調(diào)發(fā)展與人類學(xué)的理念是一致的。人類學(xué)向來(lái)堅(jiān)持“以人為本”“整體性”的理念，在旅游開(kāi)發(fā)及活動(dòng)中更應(yīng)注重環(huán)境、生態(tài)的承載力，注重作為旅游目的地的社區(qū)人民的感受和生活質(zhì)量。因此，從人類學(xué)角度出發(fā)，景區(qū)發(fā)展應(yīng)有整體性的發(fā)展規(guī)劃，構(gòu)建一個(gè)良性的循環(huán)系統(tǒng)。

在細(xì)胞形態(tài)方面，大多數(shù)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，細(xì)胞體積變小，縮成球狀，表面積與體積比增加，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的親和能力亦隨之增加，使它們可以耐受寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，并可增強(qiáng)對(duì)其他環(huán)境脅迫因子的抵抗能力，如溫度、氧化還原電位、滲透壓改變等，但有些處于VBNC狀態(tài)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞反而輕微伸長(zhǎng)。此外，VBNC細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)間隙變大，細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)泡狀小突起[2,8]。

在生理生化特性方面，VBNC細(xì)菌對(duì)底物的吸收減少，大分子物質(zhì)合成大幅度下降，細(xì)胞質(zhì)濃縮，營(yíng)養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及呼吸速率均明顯下降，核糖體和染色質(zhì)密度明顯降低，蛋白質(zhì)和脂類含量下降，但是ATP合成水平較高，細(xì)菌質(zhì)粒也不會(huì)丟失。細(xì)菌在剛進(jìn)入VBNC狀態(tài)時(shí)，會(huì)合成一些新的蛋白質(zhì)。在VBNC狀態(tài)下，細(xì)菌對(duì)多種脅迫條件的抗性增強(qiáng)。VBNC細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整但不對(duì)稱，主要膜脂含量下降，但一些短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸含量增加；細(xì)胞壁中肽聚糖的交聯(lián)程度及胞壁肽的O-乙?；潭仍鰪?qiáng)。細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的改變及新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能與VBNC細(xì)菌在不良環(huán)境下抵抗環(huán)境壓力有關(guān)[2,9]。VBNC細(xì)菌的基因表達(dá)水平也與正常細(xì)胞不同，如參與轉(zhuǎn)錄(RNA聚合酶)、翻譯、ATP合成、糖異生代謝(3-磷酸甘油醛脫氫酶)及抗氧化的基因表達(dá)水平均有所提高[2,8]。

在致病性方面，病原微生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)并不代表它們失去了致病能力。VBNC狀態(tài)的霍亂弧菌仍能產(chǎn)生霍亂毒素，并導(dǎo)致受測(cè)試人員腹瀉。然而，并非所有的VBNC病原菌都具有毒性，細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間越久，其毒力越低，甚至喪失復(fù)蘇能力[2,8-9]。

5 VBNC細(xì)菌的檢測(cè)方法

對(duì)VBNC細(xì)菌的檢測(cè)通?；谝韵路矫妫杭?xì)胞的活性或?qū)Φ孜锏奈涨闆r、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的完整性、DNA和RNA的存在以及蛋白質(zhì)的合成能力等，然而這些檢測(cè)方法只能反映細(xì)胞活性的某個(gè)側(cè)面。有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞的活性低于檢測(cè)閾值，或者不可逆失去繁殖能力的細(xì)胞仍然可檢測(cè)到代謝活性，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。唯一可以作為細(xì)胞活性檢測(cè)的充分必要標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞的復(fù)蘇和生長(zhǎng)，但是一些常用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可能并不適合于細(xì)胞的復(fù)蘇生長(zhǎng)，因此不能真實(shí)地反映出細(xì)胞的活性是否存在[6,9]。

DVC法是目前最常用的檢測(cè)方法，由徐懷恕等[1]最初采用，檢測(cè)原理是基于活性細(xì)胞對(duì)底物的吸收能力。該方法的基本要點(diǎn)為：在細(xì)菌培養(yǎng)物中添加少量的營(yíng)養(yǎng)物和DNA合成抑制劑——萘啶酮酸，培養(yǎng)6 h后固定，吖啶橙染色，然后用熒光顯微鏡觀察，如果細(xì)胞伸長(zhǎng)則說(shuō)明該細(xì)菌處于存活狀態(tài)。

死/活細(xì)菌檢測(cè)試劑盒(Live/Dead BacLight bacterial viability kit)檢測(cè)法是基于活性細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的檢測(cè)方法[23]。該試劑盒包含兩種核酸染料，即SYTO 9和碘化丙啶(Propidium iodide，PI)。SYTO 9在480/500 nm波長(zhǎng)下呈現(xiàn)綠色，且死/活細(xì)胞均能被染色；碘化丙啶由于不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌，而只能染色“死”細(xì)胞，且會(huì)減弱SYTO 9造成的綠色熒光效果，使其在490/635 nm波長(zhǎng)下呈現(xiàn)紅色，因此死、活細(xì)胞在熒光顯微鏡下分別顯示紅色和綠色。

6 VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇方法

由于VBNC應(yīng)答是細(xì)菌的一種存活機(jī)制，VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇是必要的，目前有關(guān)VBNC細(xì)菌在自然環(huán)境中如何復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)的過(guò)程尚不完全清楚。盡管已發(fā)現(xiàn)80余種VBNC細(xì)菌，但目前已報(bào)道能夠復(fù)蘇的細(xì)菌種類只有10余種，并且其復(fù)蘇刺激因子也各不相同[9]。

直接逆轉(zhuǎn)不利條件可使某些VBNC細(xì)菌復(fù)蘇[3]，采用的方法包括提高培養(yǎng)溫度、在培養(yǎng)基中添加某些營(yíng)養(yǎng)鹽、對(duì)因鹽度脅迫進(jìn)入VBNC狀態(tài)的某些細(xì)菌添加滲透壓保護(hù)劑等。大部分細(xì)菌從VBNC狀態(tài)復(fù)蘇的時(shí)間為10 天到3個(gè)月[9]。Ayrapetyan等[25]發(fā)現(xiàn)，加入密度感應(yīng)自誘導(dǎo)分子AI-2能夠誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的創(chuàng)傷弧菌復(fù)蘇。過(guò)氧化氫分解劑、丙酮酸鈉、多種氨基酸、富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等對(duì)VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇也有促進(jìn)作用[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，密度感應(yīng)系統(tǒng)能夠通過(guò)激活鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium)過(guò)氧化氫酶的表達(dá)而使其從VBNC狀態(tài)復(fù)蘇[26-27]。

在海水環(huán)境中，有些VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇可能是通過(guò)魚(yú)類及無(wú)脊椎動(dòng)物(特別是一些橈足類等浮游動(dòng)物)實(shí)現(xiàn)的。有研究者將自由生活的卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii)添加到VBNC細(xì)菌中，從而使嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)，說(shuō)明原生動(dòng)物對(duì)VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇發(fā)揮重要作用[2,8]。此外，將VBNC細(xì)菌接種于宿主體內(nèi)，也可使其復(fù)蘇。許兵等[28]通過(guò)在實(shí)驗(yàn)兔腸結(jié)扎段中注射VBNC狀態(tài)霍亂弧菌，使兔腸結(jié)扎段嚴(yán)重積水腫脹并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)兔死亡，之后采用DVC法和TCBS平板培養(yǎng)法，均可從實(shí)驗(yàn)兔腸積液中檢測(cè)到有活性的霍亂弧菌，且復(fù)蘇后的霍亂弧菌仍具有毒性。此外，也有研究表明霍亂弧菌O1減毒株的VBNC狀態(tài)細(xì)菌也可在人體內(nèi)復(fù)蘇，并保留毒性。Du等[12]將處于VBNC狀態(tài)的遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)接種到雞胚卵黃囊中，接種后第6天從雞胚內(nèi)分離出了遲緩愛(ài)德華氏菌。此外，添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并升溫至25 ℃培養(yǎng)8 d后，也可使VBNC狀態(tài)的遲緩愛(ài)德華氏菌復(fù)蘇，復(fù)蘇后的遲緩愛(ài)德華氏菌仍然對(duì)大菱鲆具有致病性。

復(fù)蘇促進(jìn)因子(Resuscitation-promoting factor，Rpf)最初發(fā)現(xiàn)于藤黃微球菌中，可促進(jìn)休眠菌的復(fù)蘇生長(zhǎng)。Rpf廣泛存在于厚壁菌門(mén)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中。Rpf 蛋白屬于水解轉(zhuǎn)糖基酶(Transglycosylase)家族，與溶菌酶的功能相似，可以水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵，在肽聚糖合成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中含有的rpf基因可高達(dá)5個(gè)[6,9]。在革蘭氏陰性細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了功能類似于Rpf的蛋白質(zhì)，如沙門(mén)氏菌屬、弧菌屬(副溶血弧菌、哈維氏弧菌等)的復(fù)蘇促進(jìn)因子YeaZ，能夠促進(jìn)VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇，但其結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌的Rpf有明顯差別，YeaZ的功能更類似于糖蛋白酶(Glycoprotease)[9,29]。

7 環(huán)境VBNC細(xì)菌的分離培養(yǎng)

自然環(huán)境中存在大量的VBNC狀態(tài)的或難培養(yǎng)的微生物，這些微生物在活性物質(zhì)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。為了提高這些微生物的分離效果，可添加促進(jìn)微生物細(xì)胞復(fù)蘇的化學(xué)物質(zhì)或改善微生物的培養(yǎng)條件等。

許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，添加藤黃微球菌的Rpf蛋白能夠促進(jìn)環(huán)境中細(xì)菌的復(fù)蘇和生長(zhǎng)；通過(guò)該方法分離到的細(xì)菌類群包括分枝桿菌屬(Mycobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和Curvibacterfontanus等[30-32]。李鴻炫[33]發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌重組Rpf蛋白能夠促進(jìn)嗜聯(lián)苯紅球菌(Rhodococcusbiphenylivoran)的生長(zhǎng)，并促進(jìn)該菌對(duì)土壤中多氯聯(lián)苯的降解，添加Rpf后土壤可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)顯著增加，各菌群豐度和多樣性也發(fā)生變化。高學(xué)宇[34]發(fā)現(xiàn)在印染廢水中添加Rpf蛋白后，新分離的沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)具有苯胺降解作用。Su等[35-36]發(fā)現(xiàn)添加藤黃微球菌Rpf蛋白能夠促進(jìn)農(nóng)業(yè)和廚余廢棄物堆肥中纖維素降解菌的分離，包括分屬于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)的博德特氏菌(Bordetella)、潘多拉菌(Pandoraea)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)和分支桿菌屬(Mycobacterium)等。研究者從能夠降解石油的紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)中克隆的重組Rpf 蛋白不僅能促進(jìn)VBNC細(xì)胞復(fù)蘇，還能促進(jìn)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)[37]，將該重組蛋白添加到環(huán)境土壤樣品中，能有效提高土壤樣品中微生物的分離效果。此外，Mu等[38]利用富集培養(yǎng)方法使近海沉積物中的VBNC細(xì)菌得到復(fù)蘇，并分離鑒定出大量的海洋細(xì)菌新分類單元。

8 總結(jié)與展望

細(xì)菌VBNC狀態(tài)概念的提出，揭示了自然界中細(xì)菌的一種抵御不良環(huán)境條件的新的休眠體形式，解開(kāi)了100多年來(lái)存在于流行病學(xué)研究中的霍亂弧菌“冬隱夏現(xiàn)”之謎，合理地闡明了該菌通過(guò)VBNC狀態(tài)進(jìn)行越冬的機(jī)制。VBNC細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)、食品安全、水質(zhì)監(jiān)測(cè)、公眾健康及流行病學(xué)研究等均提出了新的挑戰(zhàn)，也為人們?cè)u(píng)估基因工程菌的危險(xiǎn)性提供了新的依據(jù)。細(xì)菌VBNC狀態(tài)的研究，對(duì)微生物種質(zhì)資源的有效保存也具有重要意義。因?yàn)樵S多海洋細(xì)菌在4 ℃條件下保存一段時(shí)間之后，會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)，因此4 ℃可能更適合常規(guī)陸生細(xì)菌的保存，而海洋細(xì)菌更適宜于16 ℃左右或更高溫度保存。

傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)方法只能獲得環(huán)境樣品中實(shí)際微生物數(shù)量的不到1%，VBNC細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)很好地解釋了這一現(xiàn)象。海洋環(huán)境復(fù)雜多變，營(yíng)養(yǎng)、高壓、pH或鹽度等環(huán)境因子的劇烈變化都可能引起細(xì)菌的一系列改變，這些改變涉及細(xì)胞形態(tài)、主要大分子密度及結(jié)構(gòu)，以及細(xì)菌在常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力等，最終導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC的休眠狀態(tài)，得以渡過(guò)難關(guān)存活下來(lái)。通過(guò)對(duì)VBNC狀態(tài)細(xì)菌及其復(fù)蘇機(jī)制的深入研究，可以對(duì)海洋細(xì)菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行探索創(chuàng)新，有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用豐富的海洋微生物資源。目前已有研究證明復(fù)蘇因子的添加可以促進(jìn)對(duì)海洋環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的分離培養(yǎng),該研究方向有望成為該領(lǐng)域的新研究熱點(diǎn)。