陳西廣

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266237)

甲殼素/殼聚糖(Chitin/Chitosan)被稱為動(dòng)物纖維，主要是以海洋蝦蟹殼為原料提取制備，因此，稱為海洋生物多糖，是自然界中唯一的聚陽離子多糖。甲殼素/殼聚糖的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有260年歷史了，但對其深入研究和應(yīng)用是在近20年。2000年前后甲殼素/殼聚糖相關(guān)學(xué)術(shù)論文年全球發(fā)表量少于1 000篇，到2020年其年發(fā)表量已超過15 000篇，呈現(xiàn)出爆發(fā)式增長，相關(guān)研究成果在食品、輕工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、環(huán)保等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。特別是在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，因其良好的生物相容性、抑菌性、生物可降解性和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)等特性，被用于血管支架、神經(jīng)導(dǎo)管、創(chuàng)口貼、止血?jiǎng)㈩A(yù)防粘連劑和引導(dǎo)組織再生等醫(yī)用生物輔料?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)，甲殼素/殼聚糖功效的多樣性不但取決于其骨架結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，還還受到材料表觀物理形態(tài)的影響，如晶須、溶液、纖維、膜、凝膠、微/納米顆粒及3D材料等，這些特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)為其生物功效的發(fā)揮起到非常重要的作用。

1 甲殼素/殼聚糖存在與基本結(jié)構(gòu)

甲殼素是自然界中除蛋白質(zhì)外儲量最大的含氮有機(jī)物，也是僅次于纖維素的第二大天然聚多糖。主要存在于部分節(jié)肢動(dòng)物(如蝦、蟹等)、軟體動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、原生動(dòng)物、腔腸動(dòng)物、海藻以及真菌中。在甲殼綱，如蝦皮、蟹殼中甲殼素含量為20%～30%；在昆蟲綱，如蠶、蝶、蚊、蠅等蛹?xì)ぶ屑讱に睾繛?0%～60%；在多足綱，如蜘蛛、蝎等外甲中甲殼素含量達(dá)4%～22%。

甲殼素化學(xué)名稱為β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(β-(1,4)-2-acetylamino-2-deoxy-D-glucose)，是由乙酰氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)單元以β-1，4糖苷鍵構(gòu)成的直鏈聚多糖。其分子鏈規(guī)整性高，具有剛性，可形成分子內(nèi)和分子間氫鍵，因此容易形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)?；诩讱に胤肿觾?nèi)和分子間氫鍵類型的不同，自然狀態(tài)的甲殼素分為三種晶型結(jié)構(gòu)：α型、β型和γ型，分別具有不同的性質(zhì)。自然界中α-甲殼素通常與礦物質(zhì)沉積在一起，形成堅(jiān)硬的外殼，常存在于節(jié)肢動(dòng)物的角質(zhì)層和一些真菌中。β-甲殼素分子鏈以平行方式排列，具有更多的無定型結(jié)構(gòu)，多以水合物的形態(tài)存在，穩(wěn)定性較低,常存在于槍烏賊的外骨骼中。γ-甲殼素由三條糖鏈上下排列構(gòu)成，其中兩條鏈同向、一條鏈反向，屬于一種二維有序而C軸無序的結(jié)晶，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易向其他晶型轉(zhuǎn)變，主要存在于甲蟲的繭和槍烏賊外骨骼。γ-甲殼素和β-甲殼素常與膠原蛋白相聯(lián)結(jié)，表現(xiàn)出一定的硬度、柔韌度和流動(dòng)性，還具有與支撐體不同的許多功能，如電解質(zhì)的控制和聚陰離子物質(zhì)的運(yùn)送等。β-甲殼素和γ-甲殼素在一定條件下，可以轉(zhuǎn)變成α-甲殼素，如γ-甲殼素在硫氰酸鋰的作用下可轉(zhuǎn)化為α-甲殼素，β-甲殼素在6 mol/L的鹽酸中會(huì)變成α-甲殼素。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，化學(xué)名稱為β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(β-(1,4)- 2-amino-2-deoxy-D-glucose),分子鏈上分布著大量的羥基、氨基和一些殘余的N-乙酰氨基，會(huì)形成各種分子內(nèi)和分子間的氫鍵，進(jìn)而形成結(jié)晶區(qū)。殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)與其制備條件、水合程度等密切相關(guān)，呈現(xiàn)多種異構(gòu)體。氨基的質(zhì)子化導(dǎo)致殼聚糖可以在酸性水溶液中溶解，也是其與甲殼素理化性質(zhì)的基本區(qū)別。

2 甲殼素晶須結(jié)構(gòu)與性能

甲殼素晶須(Chitin whiskers, CWs)，是甲殼素的單晶形態(tài)，由甲殼素分子鏈有序堆積而成，外觀呈納米級針狀，其分子鏈排列高度有序，具有高強(qiáng)度和高模量的特點(diǎn)，是一種性能優(yōu)異、綠色環(huán)保的天然增強(qiáng)材料。CWs具有良好的生物可降解性、吸濕性、透濕性、抗菌性和生物相容性等。

我們實(shí)驗(yàn)室夏桂雪等[1]通過3 mol/L的硫酸煮沸加超聲技術(shù)獲得了CWs。透射電鏡分析表明，CWs呈長棒狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)一致，分布均勻。激光粒度儀測定CWs的長軸為(128.2±1.3) nm，短軸為(16.5±2.5) nm，zeta電位為+(23.4±) 2.6 mV。此外，CWs的雙端點(diǎn)與處理過程中的硫酸發(fā)生作用后，有 -NH3+形成，因而具有交聯(lián)劑的部分性質(zhì)。將CWs加入到羥丁基殼聚糖(Hydroxybutyl chitosan, HBC)溫敏水凝膠(HBC-HG)中以研究CWs對HBC-HG的流變學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明CWs加入后HBC-HG仍可保持溫敏性，CWs濃度與成膠溫度呈負(fù)相關(guān)，與機(jī)械強(qiáng)度呈正相關(guān)。黃亮等[2]分別制備了不同來源的CWs：雪蟹殼晶須(CWSC)、中華絨鰲蟹殼晶須(CWCC)、草蝦殼晶須(CWBS)和印度白蝦殼晶須(CWIS)，并對它們的理化性質(zhì)、尺寸、表面電荷、紅外光譜、XRD光譜、抗菌性和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行了比較(見圖1)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來源的CWs在形態(tài)和分散性方面非常相近，但粒徑分布各有不同，抑菌性能也有差異，其中 CWCC抑菌性最強(qiáng)，CWSC抑菌性最弱。抑菌性大小和Zeta電位大小呈正相關(guān)，且電荷的影響遠(yuǎn)大于尺寸的影響。用CWCC制備復(fù)合膜的楊氏模量、斷裂強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度最大，四種CWs復(fù)合膜的楊氏模量、斷裂強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度與其晶須尺寸大小成正比。

(a. 晶須的電鏡圖片; b.晶須的粒度分布 (n=3)。 a. TEM images of chitosan whiskers; b. The particle size distribution(n=3).)

3 甲殼素/殼聚糖溶解與溶液

水溶液是生物大分子之間相互作用的必然媒介，然而甲殼素和殼聚糖都是不溶于水的。甲殼素只能溶解于強(qiáng)酸性溶液、極性溶液和離子液中，為此人們不斷探索溫和的溶解方法。殼聚糖因其具有游離的氨基，可以溶解于稀醋酸溶液中，成為其常用溶劑，但酸溶液中水解導(dǎo)致的分子量下降和粘度不穩(wěn)定成為其應(yīng)用的主要障礙。本研究團(tuán)隊(duì)劉楠等[3]利用醋酸降解，研究了殼聚糖溶液的抑菌活性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在殼聚糖濃度高于200 mg/s才會(huì)顯示出抑菌性，且低分子量殼聚糖對大腸桿菌(E.coli)的抑菌性要高于高分子量，而中分子量殼聚糖(9.0×104Da)反而會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生長。李燕等[4]改進(jìn)了溶解方法，采用非均相技術(shù)制備了固體殼聚糖醋酸鹽，溶解后24 h內(nèi)降解緩慢，并用瓊脂平板法證明了0.15%(m/v)濃度的殼聚糖醋酸鹽對金黃色葡萄球菌(S.aureus)和E.coli均具有100%的抑制效果。黨奇峰等[5]用殼聚糖醋酸鹽溶液涂覆在水果表面作為保鮮涂層，發(fā)現(xiàn)其具有抑菌和防止水分流失的作用，同時(shí)還可以誘導(dǎo)水果內(nèi)過氧化物酶活性的增強(qiáng)，是一種很有潛力的食品保鮮材料。

化學(xué)修飾也是獲得甲殼素/殼聚糖溶液(的)主要方法。陳西廣等[6-7]研究報(bào)道了水溶性羧甲基化殼聚糖(O-carboxymethyl chitosans)，其在水溶液中具有促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞生長和抑制瘢痕成纖維細(xì)胞生長的活性。李晶晶等[8]研制了羥丁基殼聚糖(HBC)，其水溶液具有溫度敏感性，可以實(shí)現(xiàn)溶液-凝膠兩種狀態(tài)間的可逆轉(zhuǎn)變，是一種新型醫(yī)用生物材料。周忠政等[9]研究了季銨鹽殼聚糖(Quaternary ammonium chitosan)，其溶液的抑菌活性得到極大提高。

甲殼素/殼聚糖的堿/尿素溶解體系是目前最新的溶解技術(shù)，最早由張麗娜等[10-12]提出，主要應(yīng)用于纖維素的綠色溶解，隨后被證明也適用于溶解甲殼素/殼聚糖，該技術(shù)需要低溫(-20 ℃)和反復(fù)凍融。在此基礎(chǔ)上，本研究團(tuán)隊(duì)的畢世超等[13-14]通過KOH 與NaOH替換，以及殼聚糖預(yù)處理，縮短了溶解時(shí)間，實(shí)現(xiàn)2 h內(nèi)溶解，過程綠色、溫和，建立了KOH/尿素速溶體系。研究結(jié)果表明，該殼聚糖溶液4 ℃存放30 d仍保持良好的穩(wěn)定性。緊密水合半徑更小的K+能夠形成比Na+更加穩(wěn)定的復(fù)合氫鍵結(jié)構(gòu)，是KOH/尿素體系比NaOH/尿素體系熱穩(wěn)定性更高的內(nèi)在因素(見圖2)。這種新的溶解體系將在甲殼素/殼聚糖均相化學(xué)修飾和生物材料制造等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力。

此外，經(jīng)生物酶、酸堿、微波等技術(shù)降解后，高聚合度的甲殼素/殼聚糖可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿恿康陀?00 00 Da的殼寡糖，也具備溶解度高、易吸收、生物活性強(qiáng)等諸多特性[15]。

(a. X射線衍射; b.傅里葉紅外光譜; c. 13C 核磁共振圖譜; d. 溶解機(jī)制圖. a. X-ray diffraction, b. FTIR; c. 13C NMR; d. dissolution and the mechanism.)

4 甲殼素/殼聚糖水凝膠

水凝膠是由高分子聚合物與水組成的三維網(wǎng)絡(luò)體系，類似于天然生物組織,是一類新型的生物材料，被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷敷料、藥物釋放、細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程支架等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。甲殼素/殼聚糖水凝膠因其良好的生物相容性、抑菌性、生物可降解性以及多方面的生物學(xué)活性而備受關(guān)注。

Chenite A等[16]和Ruel-Gariépy E等[17]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖稀醋酸溶液在低溫下與β-甘油磷酸(Glycerol-β-phosphate)共混，升溫到37 ℃能夠形成穩(wěn)定的水凝膠。本研究團(tuán)隊(duì)的周慧云等[18-19]用α，β-甘油磷酸(Glycerol-α，β-phosphate)制備了可注射型殼聚糖水凝膠(CS-α，β-GP)，pH為6.8～7.2。發(fā)現(xiàn)溶液在低溫下是由弱堿性的甘油磷酸鹽以靜電方式與殼聚糖分子上的氨基結(jié)合，保持水合狀態(tài)，因此在中性條件下也不發(fā)生沉淀；當(dāng)溫度逐漸升高，體系中的氫鍵減弱，殼聚糖分子間的疏水作用增強(qiáng)，分子鏈相互纏繞交聯(lián)，體系由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。吉秋霞等[20-21]利用殼聚糖(CS)、季銨鹽殼聚糖(HTCC)復(fù)配α,β-GP制備了可原位注射溫敏水凝膠(CS/HTCC-GP)。發(fā)現(xiàn)CS/HTCC-GP的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度可控制在25 ℃以上，且能夠包載和緩釋生長因子，表現(xiàn)出優(yōu)良的促進(jìn)牙周組織再生效果；并且CS/HTCC-GP對常見牙周致病菌-牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、中間普氏菌(Prevotellaintermedia)和伴放線放線桿菌(Actinobacillusantinomycetemcomitans)有較強(qiáng)的抑制效果。黨奇峰等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)對蝦淋巴細(xì)胞能夠在CS-α，β-GP水凝膠上進(jìn)行2D、3D培養(yǎng)和傳代。吳廣升等[24]研究發(fā)現(xiàn)用CS-α，β-GP可以實(shí)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞源性因子-1α和antimiR-138的原位控釋，并促進(jìn)顱骨再生。

本研究團(tuán)隊(duì)的李晶晶等[8,25]制備了羥丁基殼聚糖水凝膠(HBC-gel),不需任何交聯(lián)劑,僅通過升/降溫度即實(shí)現(xiàn)溶液/凝膠之間的相轉(zhuǎn)變，具有熱可逆性。研究發(fā)現(xiàn)HBC-gel無細(xì)胞毒性、溶血率低、體內(nèi)可降解、組織相容性良好。包子?jì)沟萚26-27]利用HBC-gel制備了包載5-氟尿嘧啶和地塞米松磷酸鈉雙藥體系，開展了皮膚瘢痕組織修復(fù)研究，建立了瘢痕組織離體培養(yǎng)研究模式(見圖3)，并發(fā)現(xiàn)其能夠使瘢痕組織的結(jié)節(jié)狀膠原束逐漸變細(xì)，變松散，檢查到組織塊中膠原束出現(xiàn)了先減少后增加的現(xiàn)象。

Duan等[28]結(jié)合低溫冷凍和LiOH/KOH/尿素溶劑體系制備了高強(qiáng)度殼聚糖水凝膠。本研究團(tuán)隊(duì)畢世超等[29-30]構(gòu)建了羥基磷灰石表層礦化殼聚糖/聚乙烯醇雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(見圖4)。研究結(jié)果表明礦化增強(qiáng)了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、抗溶脹性和疏水性，表面微觀結(jié)構(gòu)有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼附、增殖和成骨分化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能夠降低骨損區(qū)炎癥反應(yīng)、提升成骨指示蛋白表達(dá)量，加速缺損部位骨再生和修復(fù)。

5 甲殼素/殼聚糖海綿

甲殼素/殼聚糖溶液中加入膨化試劑或者直接凍干，可以制備成海綿狀結(jié)構(gòu)。其具有多孔、比表面積大、透氣性和吸水性；還能夠保持創(chuàng)面濕潤、抗菌、止血、保護(hù)創(chuàng)面和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)，已被臨床應(yīng)用于醫(yī)用生物輔料。但由于殼聚糖的水不溶性，其海綿的親水性較差，不能達(dá)到與創(chuàng)面無縫銜接或大面積傷口使用。本實(shí)驗(yàn)室胡世浩等[31]采用殼聚糖醋酸鹽溶液和羥丁基殼聚糖(HBC)共混，制備成復(fù)合海綿(CS-HBC)。實(shí)驗(yàn)證明CS-HBC保持了殼聚糖原有的機(jī)械強(qiáng)度和性能，提升了親水性(見圖5a)。研究發(fā)現(xiàn)CS-HBC復(fù)合海綿的孔徑大小取決于殼聚糖與HBC的比例 (見圖5b-f)；CS-HBC可將游離水轉(zhuǎn)化成結(jié)合水，長時(shí)間鎖住水分維持傷口濕潤環(huán)境；CS 在復(fù)合海綿中起物理支撐作用，使HBC在水合態(tài)下保持良好的三維結(jié)構(gòu)。CS-HBC支持上皮細(xì)胞的浸潤、爬行、生長，能夠加速創(chuàng)面愈合，并減少疤痕的產(chǎn)生；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CS-HBC對革蘭氏陽性菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌(E.coli)都具有很好的抑制效果，其浸提液(60 mg/mL)的抑菌率達(dá)到了100%。

6 甲殼素/殼聚糖膜

甲殼素/殼聚糖作為高分子天然多糖具有良好的成膜性、生物相容性好、可被生物降解等優(yōu)點(diǎn)，可被用作細(xì)胞培養(yǎng)支持物、藥物緩釋的載體、傷口愈合材料等。早在1985年，Popowicz等[32]用殼聚糖醋酸溶液蒸發(fā)制成透明薄膜，成功地用于細(xì)胞培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞保持了與體內(nèi)一樣的生長形態(tài)和許多功能。隨后，殼聚糖膜被制成人造皮膚，臨床應(yīng)用證明其不致敏、無刺激、無排斥、透氣性好，可促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長，且有抑菌、止血和抑制瘢痕生長的效果，還把抗菌、抗病毒、抗炎等藥物加入其中，將其植入患病處或口、鼻、粘膜等處，實(shí)現(xiàn)長時(shí)間持續(xù)給藥治療效果。

本研究團(tuán)隊(duì)的陳西廣等[33]研究了不同分子量殼聚糖膜與生理小分子之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)其對氯化鈉、葡萄糖和氨基酸類均具有親和性和透過性。鄭立等[34]制備了不同分子量的殼聚糖膜與羧甲基殼聚糖膜(CMCH)，研究了皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖和CMCH在成膜性和通透性上都依賴于分子量；成纖維細(xì)胞可在兩種膜上貼附和生長，不聚集脫落；并發(fā)現(xiàn)CMCH膜可以明顯促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的生長，且分子量越小，作用越顯著。倪思亮[35]在此研究基礎(chǔ)上，加入了PVA層，采用流延法制備了殼聚糖/PVA/羧甲基殼聚糖三層復(fù)合膜(C-P-C)。 該復(fù)合膜是一種不對稱膜，上層是具有抑菌作用的殼聚糖膜，中間是高韌性的PVA膜，下層是具有促進(jìn)組織修復(fù)效果的羧甲基殼聚糖膜(見圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C-P-C透光性達(dá)80%以上，水蒸氣通透性達(dá)到2 500 g·m-2·d-1，接近于人工皮膚理想狀態(tài)的透氣性指標(biāo)。 C-P-C復(fù)合膜對S.aureus、E.coli、白色念珠菌(C.albicans)均有接觸性抑制；能明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合，有效地密封出血?jiǎng)?chuàng)面，有良好的創(chuàng)傷保護(hù)和修復(fù)功能，為其作為皮膚修復(fù)材料提供了理論依據(jù)。

(a. 5-FU/DEXSP與HBC水凝膠復(fù)合；b. 瘢痕疙瘩組織切片(Φ=4 mm); c. 瘢痕疙瘩活檢的治療, i：5-FU/DEXSP/HBC組，WE培養(yǎng)基培養(yǎng)0天；ii：HBC組，含5-FU/DEXSP-5 的WE培養(yǎng)基培養(yǎng)0天。 兩組均每日更換一半培養(yǎng)基，補(bǔ)充新鮮WE培養(yǎng)基至7 d。a. Incorporation of 5-FU and DEXSP into the HBC hydrogel. B. Keloid tissues were dissected into biopsies (4 mm diameter). C.Treatment of keloid biopsies. Group i, the keloid biopsies were embedded in the 5-FU/DEXSP/HBC-5 hydrogel, and cultured with WE culture medium on day 0; Group ii, the keloid biopsies were embedded in the HBC hydrogel, and cultured with WE culture medium containing 5-FU/DEXSP-5 solution on day 0. For both groups, half of the culture medium was changed every day and supplemented with fresh WE medium up to 7 days.)

(a.將凝膠柱(直徑5 mm，長度8 mm)植入缺損(直徑5 mm，深度8 mm)股骨外側(cè)髁骨中；b.骨缺損模型的CT圖像。(前、縱、橫)；c.術(shù)后4、8、12周骨缺損的CT圖像。(比例尺：1 cm)a.Illustration of gel implantation in the bone defect (5 mm in diameter and 8 mm in deep) created in the lateral femoral condyle, and a cylindrical shaped test samples (5.2 mm in diameter and 8 mm in length) were implanted into the bone defect; b. CT images of bone defects model. (Front, Longitudinal section and Cross section); c. CT images of gel implanted and nonimplanted bone defects after 4, 8 and 12 weeks. (Scale bar: 1 cm))

(a.復(fù)合海綿照片(直徑13 mm;厚10 mm);b～f. 海綿多孔結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)構(gòu)：CS、HC-1、 HC-2、 HC-3、HBC。A. Photograph of the sponge samples (13 mm diameter, 10 mm thickness). b～f. SEM image of the interior porous structure of the CS, HC-1, HC-2, HC-3, HBC.)

圖6 C-P-C三層復(fù)合人工皮膚支架模型圖Fig.6 Design of the C-P-C triple-layer artificial skin scaffold

7 甲殼素/殼聚糖纖維

甲殼素因難溶解的問題，其纖維制備還存在技術(shù)障礙。目前能夠?qū)崿F(xiàn)殼聚糖纖維制備，包括普通纖維和納米纖維。殼聚糖纖維(CS-fiber)具有諸多優(yōu)良特性，如透氣、吸濕、生物相容、抑菌等，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如創(chuàng)口貼、止血紗布、止血棉球、手術(shù)縫合線和組織工程支架等。然而，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)CS-fiber存在韌性低、吸水少、抑菌效果差等缺陷，對其醫(yī)用功效有一定的限制。

顏冬等[36-37]通過軟糖纖維表層羧甲基化(CMCS)改性，制備了不同羧化度的殼聚糖纖維(見圖7)。發(fā)現(xiàn)其吸水溶脹效率顯著提高，并與取代度成正比(見圖7A)；溶脹后纖維表面呈凝膠狀(見圖7B)； CMCS纖維可抑制90%以上的S.aureus和80%以上的E.coli。孫國輝等[38]制備了琥珀酰改性的殼聚糖纖維(NSCS)，其溶脹率提高了近10倍，相比于CMCS纖維，NSCS纖維吸水性更優(yōu)越。夏桂雪等[39]研究發(fā)現(xiàn)NSCS纖維的琥珀?；鶊F(tuán)可水解產(chǎn)生質(zhì)子，供給氨基質(zhì)子化，中性環(huán)境中對E.coli和S.aureus的抑制率均達(dá)90%以上。周忠政等[9]制備了季銨化殼聚糖纖維(TMCS)，隨著纖維表面季銨化程度提升，抑菌率也相應(yīng)提高，高取代度(32%)TMCS纖維對E.coli的抑制率可達(dá)90%，對S.aureus可達(dá)99%，抑菌功效得到了極大提升。研究發(fā)現(xiàn)相比CS纖維，CMCS、NSCS和TMCS纖維無紡布可快速吸附傷口滲出血液。不同CS改性纖維表現(xiàn)出不同的止血效果，并與修飾基團(tuán)和取代度密切相關(guān)。例如，NSCS纖維攜帶負(fù)電荷，可引發(fā)內(nèi)源性凝血，在兔耳出血模型實(shí)驗(yàn)中止血效果更佳(見圖8)。

總之，經(jīng)表面親水改性的殼聚糖纖維，可吸附傷口滲出液形成凝膠，為傷口提供濕潤的愈合環(huán)境，提高了抑菌活性，避免創(chuàng)面感染，并易于從傷口表面剝離，避免產(chǎn)生二次傷害。通過控制取代度，可實(shí)現(xiàn)溶脹行為僅發(fā)生在纖維表面，而核心仍保持纖維形態(tài)，維持敷料的機(jī)械性能。

(A. CS-fiber和不同取代度的CMCS纖維的溶脹率(CS：CS-fiber，CMCS1：15.0%，CMCS2：20.6%，CMCS3：30.2%)；B. 顯微照片：(a)干燥CS-fiber，(b)濕潤C(jī)S-fiber,(c)干燥的CMCS纖維,(d)濕潤的CMCS纖維。(比例尺：100 μm)A. The swelling rate of CS-fiber and CMCS fiber (CS：CS-fiber，CMCS1：15.0%，CMCS2：20.6%，CMCS3：30.2%)；B. The micrographs of fiber：(a)dried CS-fiber，(b)wet CS-fiber,(c)dried CMCS fiber,(d)wet CMCS fiber. (Scale bar: 100 μm))

8 甲殼素/殼聚糖微米球

微球狀甲殼素/殼聚糖(Chitin/chitosan microspheres, CM)一般指粒徑范圍在幾微米到毫米的球狀結(jié)構(gòu)，具有良好的分散性和流動(dòng)性。在載藥、吸附、緩釋、細(xì)胞微載體、植入栓塞劑等醫(yī)用生物材料領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。根據(jù)需求的不同，其制備方法有多種，主要包括：乳化交聯(lián)法(化學(xué)交聯(lián)、離子交聯(lián)和物理交聯(lián))、凝聚法、溶劑蒸發(fā)法、溶液包衣法、乙酰化法、噴霧法等。不同技術(shù)制備的CM在物理形態(tài)方面有明顯的差異，如：光滑型、粗糙型、多孔型、空心型、實(shí)心型以及親水型和疏水型等，其功效性能也明顯不同。

本研究團(tuán)隊(duì)陳西廣等[40]曾用乳化交聯(lián)技術(shù)制備了光滑型的CM，粒徑分布在100～200 μm，密度1.01～1.06 g/cm3，比表面積3 000～4 000 cm2/g，擾動(dòng)下能夠懸浮于培養(yǎng)基中，靜置時(shí)自然下沉(見圖9)。實(shí)驗(yàn)表明，該微球具有良好的細(xì)胞貼壁性，適合貼壁依賴性細(xì)胞附著和高密度生長，是一種良好的細(xì)胞生長微載體。孔明[41]通過對CM表面基團(tuán)修飾，制備了疏水界面(乙酰化，油?；?微球，和強(qiáng)親水界面(羧甲基化)微球，用其建立了一種新型的殼聚糖抑菌分散體。研究表明，微球界面疏水性提高，能加快其表面細(xì)菌菌膜的滲透性，導(dǎo)致菌膜破壞和菌體死亡(見圖10)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)用微球體系開展抑菌性研究，可以排除殼聚糖分子進(jìn)入菌體內(nèi)的干擾因素，是研究殼聚糖界面接觸抑菌及其機(jī)理的理想模型。張維芬[42-44]采用噴霧干燥技術(shù)制備的復(fù)合CM具有蓬松的內(nèi)外結(jié)構(gòu)，粒徑分布在0.5～7 μm，可顯著提高茶堿的攜載量，提高其用于肺吸入給藥的生物利用度，是一種新型的哮喘治療藥物制劑。

(A.兔耳動(dòng)脈損傷模型; B. 止血時(shí)間和總失血量：紗布(Gauze)、殼聚糖纖維(CS)、低取代度琥珀酰殼聚糖纖維(NSCS1)、羧甲基殼聚糖纖維(CMCS1)和季銨化殼聚糖纖維(TMCS1)。(比例尺：1 cm)A. Rabbit artery injury model; B. Hemostasis time and total blood loss: Gauze, chitosan fiber(CS), succinyl chitosan fiber(NSCS1)、CM-chitosan fiber(CMCS1)and quaternary ammonium chitosan fiber(TMCS1). (Scale bar: 1 cm)

(A. 空白微球; B. 皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)120 h。比例尺：100 μm，D比例尺1 μm。 A. The chitosan microcarrier beads; B. The skin fibroblast growth on the beads 120 h. Scale bar: 100 μm.)

(A. 殼聚糖微球與油酰殼聚糖微球; B. 殼聚糖微球作用于S. aureus; C. 殼聚糖微球與油酰殼聚糖微球; D. 殼聚糖微球作用于E. coli。A、B、C比例尺：10 μm，D比例尺1 μm。A. Chitosan microspheres and oleoyl chitosan microspheres; B. S. aureus on chitosan microspheres; C. Chitosan microspheres and oleoyl chitosan microspheres; D. E. coli on chitosan microspheres. Scale bar for A, B and C was 10 μm，for D was 1 μm)

此外，基于CM粒徑分布的可控性和生物相容性，其可被應(yīng)用于血管栓塞劑。本研究團(tuán)隊(duì)的王啟釗等[45]用乳化交聯(lián)制備可變形CM，并進(jìn)行了表面親/疏水修飾。所制備的CM表面光滑，且粒徑分布均一，體外血管栓塞實(shí)驗(yàn)效果良好。 在此基礎(chǔ)上，周旋等[46]對乙酰殼聚糖微球進(jìn)行了動(dòng)物栓塞實(shí)驗(yàn)研究，研究發(fā)現(xiàn)兔耳動(dòng)脈栓塞后3 d，兔耳發(fā)炎水腫，耳尖血管發(fā)黑、結(jié)痂；栓塞后7 d，兔耳消腫，耳尖明顯發(fā)黑、結(jié)痂、缺血性壞死；栓塞15 d，耳尖部位小動(dòng)脈萎縮消失，周圍組織干性壞死，部分發(fā)生脫落。表明該栓塞微球能有效的阻止血液流動(dòng)，栓塞效果顯著。

9 甲殼素/殼聚糖納米載體

納米藥物載體是一種屬于納米級范疇的亞微粒藥物遞送系統(tǒng)，近年來，在生物、醫(yī)療和制藥領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展空間。殼聚糖具有親水性，這一性質(zhì)可以減少其納米顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬，有利于體內(nèi)循環(huán);同時(shí),殼聚糖良好的生物相容性、無毒性、生物可降解性使其更加安全。殼聚糖納米顆粒(Chitosan nanoparticles)的制備有很多報(bào)道，包括：共價(jià)交聯(lián)法、離子交聯(lián)法、沉淀析出法、大分子復(fù)合法、自組裝法等。殼聚糖納米組裝始見于1995年, Amiji[47]用單分子熒光探針吡，發(fā)現(xiàn)了殼聚糖在水溶液中產(chǎn)生的自聚集現(xiàn)象。之后Lee等[48]將脫氧膽酸接枝到殼聚糖分子鏈上，強(qiáng)化了殼聚糖的定向自聚集性，制備的納米級膠束可以裝載和遞送基因。

本研究團(tuán)隊(duì)陳西廣等[49]曾采用亞油酸修飾殼聚糖成功制備了自組裝納米載體(Oleyl chitosan nano-carriers, OCNC)，粒徑200～600 nm，核心富亞油酸基，呈疏水性；外殼則富集殼聚糖，呈親水性。OCNC具有攜載脂溶性藥物(維生素E)的功能，可以良好的分散在水相中。李彥艷等[50-51]采用油酸修飾殼聚糖實(shí)現(xiàn)了自聚集納米載體的制備，并完成了抗菌藥物利福平(rifampicin)的包載和釋藥。在此基礎(chǔ)上，刑珂等[52-54]進(jìn)行了殼聚糖納米抑菌體系構(gòu)建。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對E.coli和S.aureus最小抑菌濃度在31.25～125 mg/L之間，是通過吸附于細(xì)菌表面，誘導(dǎo)細(xì)胞壁破裂，胞漿溢出實(shí)現(xiàn)有效殺菌。張靜等[55-58]將化療藥物阿霉素(doxorubicin)包載于油酰殼聚糖納米載體中，研究了A549 cells對殼聚糖納米藥物的攝取，結(jié)果顯示納米載體表現(xiàn)出良好的藥物遞送功能和抗腫瘤活性?？酌鞯萚59-60]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米載體能夠顯著提高細(xì)胞透過效率，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)釋藥，達(dá)到抗癌目的。

本研究團(tuán)隊(duì)的劉雅等[61-64]采用殼聚糖納米顆粒作為載體實(shí)現(xiàn)了疫苗的口服遞送，采用雙親性殼聚糖衍生物與透明質(zhì)酸制備復(fù)合納米顆粒，包載細(xì)菌抗原分子(蛋白質(zhì)及DNA)，對鯉魚進(jìn)行口服給藥，能夠在鯉魚的血清中檢測到高水平的抗體，達(dá)到很好的口服免疫效果。高萍等[65]用殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米粒包載卵清蛋白進(jìn)行口服疫苗遞送，并檢測了納米載體在大菱鲆體內(nèi)36 h的分布情況，結(jié)果顯示熒光納米粒主要分布在后腸、肝臟和脾臟中，顯著提高了疫苗的口服利用率。馮超等[66-68]采用殼聚糖與CMCS復(fù)合納米載體包載化療藥物DOX，研究其在大鼠小腸部位的吸收效率(見圖11)。結(jié)果表明，DOX在大鼠小腸部位實(shí)現(xiàn)了有效的滲透和吸收，生物利用度達(dá)到42%。王娟等[69-70]制備兩種了表面電荷相反的殼聚糖/CMCH復(fù)合納米載體，粒徑240～260 nm，對于胰島素的包封率和載藥率分別達(dá)到了75%和30% 。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，負(fù)電荷納米載體對血糖控制效果要明顯優(yōu)與正電荷組。并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了腸道粘膜吸收的兩個(gè)途徑：(1)通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)，以及非網(wǎng)格蛋白依賴性的內(nèi)吞途徑，經(jīng)腸道細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體循環(huán)；(2)通過打開細(xì)胞間緊密連接，經(jīng)細(xì)胞旁途徑進(jìn)入體循環(huán)(見圖12)。殼聚糖納米顆粒羧甲基可以打開細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)胞間吸收，這一作用可能是通過改變緊密連接蛋白claudin-4 的去磷酸化水平來實(shí)現(xiàn)的。

圖11 殼聚糖復(fù)合納米藥物DOX:CS/CMCS/TPP NGs 和 DOX:CS/CMCS/Ca2+ NGsFig. 11 Preparation of DOX:CS/CMCS/TPP NGs and DOX:CS/CMCS/Ca2+ NGs

本研究團(tuán)隊(duì)的楊奎昆等[71-72]制備的葉酸-HBC納米載體，研究結(jié)果表明，其具有乳腺癌靶向性和溫度敏感性，能實(shí)現(xiàn)在腫瘤組織內(nèi)部高效釋藥。周忠政等[73]用季銨鹽化殼聚糖制備了納米載體，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了其能夠靶向作用于口腔菌斑生物膜，并提高抗菌藥物的定向殺菌能力。胡芳等[74]的研究表明，季銨化殼聚糖/脂質(zhì)體/多西環(huán)素復(fù)合納米粒對牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和中間普氏菌(Prevotellaintermedia)的抑制能力相比季銨化殼聚糖提高了三倍。而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合納米?？筛街谘例l表面，持續(xù)殺滅細(xì)菌，并阻止細(xì)菌生物膜的形成。于曉萍等[75]采用物理包埋與化學(xué)接枝相結(jié)合，將西替利嗪(Cetirizine)包載到殼聚糖納米顆粒中，制備了雙級釋藥的納米載體，體外實(shí)驗(yàn)取得了良好的鼻黏膜給藥效果，適用于慢性鼻炎的局部用藥。

(A. 藥物透過率：Insulin: CMCS/CS-NPs(+)和insulin:CMCS/CS-NPs(-)中的胰島素在Caco-2細(xì)胞單層中4 ℃的表觀滲透系數(shù)(Papp)(n=4)；B. 納米載體透黏膜機(jī)制B：CMCS/CS納米粒介導(dǎo)的可逆的緊密連接(TJ)開放機(jī)制。A. Drug transmittance：insulin:CMCS/CS-NPs(+) and insulin:CMCS/CS-NPs(-) on Caco-2 monolayer,(4 ℃, n=4)；B. The mechanism of nanaocarrier through mucosa：Reversible tight junction (TJ) opening mechanism mediated by CMCs / CS-NPs.)

殼聚糖還可以制備成更多有特殊功能的復(fù)合納米載體，例如我們實(shí)驗(yàn)室馬方奎等[76]制備了殼聚糖-PLGA復(fù)合納米載體，李靜等[77]制備了殼聚糖-PLA復(fù)合納米載體；馮超等[78]制備了多層復(fù)合殼聚糖-褐藻膠納米遞送載體。大量的研究結(jié)果表明，納米狀態(tài)的殼聚糖載體具有良好載藥、遞藥和釋藥等功能，在納米藥物領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

10 甲殼素/殼聚糖的3D打印材料

3D生物打印是指能夠?qū)⒓?xì)胞、生長因子和支架結(jié)合在一起形成整體結(jié)構(gòu)的一種新興技術(shù)，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)不同類型的細(xì)胞在支架內(nèi)部準(zhǔn)確定位，進(jìn)行有序的相互作用，實(shí)現(xiàn)組織功能化。適合殼聚糖的3D打印技術(shù)，需要在常溫或者低溫下進(jìn)行，尤其是復(fù)合有細(xì)胞或生長因子等活性物質(zhì)的打印，條件更加苛刻，既要求材料具有一定的流動(dòng)性，保證快速精確打印，又要具有合適的固化方法，能完成立體塑形，同時(shí)在打印過程中還要保持細(xì)胞等的生物活性。因此，殼聚糖所具有的多種物理形態(tài)有利于其3D生物打印領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，如殼聚糖溫敏水凝膠、微球、納米載體、晶須等都可以作為3D生物打印的良好“墨水”。 單獨(dú)殼聚糖材料的力學(xué)性能比較差，殼聚糖水凝膠與細(xì)胞等組裝形成的三維結(jié)構(gòu)沒有抗壓能力或抗縫合能力，因此需要將殼聚糖與其他材料如生物陶瓷、聚合物等結(jié)合起來，才能為細(xì)胞形成功能組織(或器官)提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和環(huán)境。打印功能化殼聚糖基生物支架，還需要制造技術(shù)、材料科學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科交叉結(jié)合。整個(gè)打印系統(tǒng)工藝還需要進(jìn)行生物安全性評估和相應(yīng)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)考核。因此，通過3D生物打印實(shí)現(xiàn)組織或器官的修復(fù)和功能重建，將是一項(xiàng)長期且很有意義的科研方向。

11 總結(jié)與展望

甲殼素/殼聚糖已經(jīng)成為日益重要的醫(yī)用生物材料，其物理結(jié)構(gòu)，特別是其微納米結(jié)構(gòu)和物理形態(tài)對其活性功效的發(fā)揮起到越來越不可忽視的作用，且在創(chuàng)傷修復(fù)、組織引導(dǎo)再生、抑菌、止血、智能化、藥物遞送和3D打印材料等領(lǐng)域不斷被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。這些研究結(jié)果為甲殼素/殼聚糖在醫(yī)用生物材料制造和相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了良好的引導(dǎo)和借鑒，但進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用仍然極具挑戰(zhàn)性，需要廣大科研工作者的不懈努力。

致謝：本文在資料整理和撰寫過程中得到了程曉杰、孔明、劉雅、馮超、畢世超、王夢陽等同仁的大力協(xié)助，一并致謝！