李紅巖, 張祥敏, 楊帥奇

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

C型凝集素(C-type lectins，CTLs)是指一類需要鈣離子參與選擇性結(jié)合糖類物質(zhì)的蛋白超家族，是凝集素家族中種類和數(shù)量最多的一個(gè)家族，廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中[1-2]。C型凝集素通常含有一個(gè)至多個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域(Carbonhydrate-recognition domain，CRD)[2-3]，該結(jié)構(gòu)域一般含有110～130個(gè)氨基酸，是典型的雙環(huán)結(jié)構(gòu)[1，3-5]。EPN/QPD和WND是該結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)高度保守的氨基酸基序，與糖類物質(zhì)的特異性識別有關(guān)，可以通過這兩個(gè)基序預(yù)測C型凝集素結(jié)合糖類物質(zhì)的特異性[1，6]。糖識別結(jié)構(gòu)域可以特異性識別和結(jié)合入侵病原微生物細(xì)胞壁中的糖類物質(zhì)，從而引起機(jī)體免疫反應(yīng)[7]。除糖類外C型凝集素還可以識別多種配體，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和尿酸晶體等[8-9]。大部分C型凝集素和配體結(jié)合都需要鈣離子的參與，但最近有研究表明，部分C型凝集素也可以在沒有鈣離子存在的情況下識別配體，這一現(xiàn)象在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中均有報(bào)道[1,10-11]。

作為一類重要的模式識別受體(Pattern-recognition receptor，PRR)，C型凝集素可以識別和結(jié)合多種配體，具有介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用、調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)及炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)凋亡、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、抗原呈遞等功能，在免疫防御中發(fā)揮重要作用[12-18]。

C型凝集素在脊椎動(dòng)物中的研究較為廣泛深入。研究表明C型凝集素在脊椎動(dòng)物免疫過程中發(fā)揮重要作用[19-23]，樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1 (Dendritic cell-associated C-type lectin-1, Dectin-1)、樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-2(Dendritic cell-associated C-type lectin-2, Dectin-2)、巨噬細(xì)胞C型凝集素(Macrophage C-type lectin, MCL)等與病原微生物結(jié)合后通過激活Syk信號通路進(jìn)行相關(guān)抗原的交叉呈遞，從而引起機(jī)體免疫反應(yīng)[21]；樹突狀細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞凝集素群受體1(Dendritic cell NK lectin Group Receptor-1, DNGR-1)與壞死細(xì)胞暴露的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合后，通過Syk信號途徑將與壞死細(xì)胞相關(guān)的抗原交叉呈遞，進(jìn)而清除壞死細(xì)胞[22]；Dectin-1有助于識別癌癥相關(guān)配體和增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK)殺死癌細(xì)胞的活性[23]。

作為先天性免疫因子，C型凝集素在無脊椎動(dòng)物免疫過程中也起著重要作用。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的LvCTL5可以抑制細(xì)菌生長[24]；菲律賓蛤仔(Venerupisphilippinarum)的 MCL-4 具有抑菌和增強(qiáng)血強(qiáng)胞吞噬活性[25]；黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的DL2、DL3能夠凝集細(xì)菌[26]；家蠅(Muscadomestica)的MdCTL-2具有抗病毒作用，能夠抑制甲型H1N1流感病毒的復(fù)制[27]。

雖然海洋生物C型凝集素研究起步較晚，但近期取得了豐富的研究成果。本文將對海洋軟體動(dòng)物、海洋節(jié)肢動(dòng)物、海洋棘皮動(dòng)物、海洋脊索動(dòng)物和海洋脊椎動(dòng)物等中的C型凝集素研究進(jìn)展和現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 海洋軟體動(dòng)物C型凝集素研究現(xiàn)狀

海洋軟體動(dòng)物中C型凝集素的研究較多，主要集中在雙殼綱一些具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋貝類中。研究表明海洋軟體動(dòng)物中含有多種C型凝集素，如已發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中至少存在5種C型凝集素；海灣扇貝(Argopectenirradians)中至少含有9種[12]。之前已有關(guān)于軟體動(dòng)物中C型凝集素的功能以及糖識別結(jié)構(gòu)域特征的相關(guān)綜述[28]。本文主要從軟體動(dòng)物中C型凝集素的結(jié)構(gòu)特征、組織分布和免疫功能等方面進(jìn)行綜述。

軟體動(dòng)物C型凝集素的結(jié)構(gòu)多樣化。大部分C型凝集素含有一個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域，少部分含有3或4個(gè)，但至今尚未發(fā)現(xiàn)多于4個(gè)的。對于含有多個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域的C型凝集素，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能并不完全相同，因此含有多個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域的C型凝集素?fù)碛懈鼜V泛的識別圖譜[12]。部分C型凝集素含有信號肽可能編碼分泌蛋白，作為分泌蛋白起作用，而有的則含有跨膜結(jié)構(gòu)域，可能作為膜受體發(fā)揮作用[29]。

研究表明海洋軟體動(dòng)物大部分C型凝集素在多個(gè)組織器官中均有表達(dá)，如在腎、肌肉、心臟、神經(jīng)節(jié)、外套膜、肝胰腺和血淋巴等組織器官中表達(dá)[12，30-33]，但是在肝胰腺或血淋巴中的表達(dá)量明顯高于其他組織。菲律賓蛤仔(V.philippinarum)的VpClec-1和VpClec-2[34]、螠蟶(Sinonovaculaconstricta)的ScCTL-1[35]等在肝胰腺中的表達(dá)量最高，而華貴櫛孔扇貝(Mimachlamysnobilis)的Cnlec-1[36]、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的CgCLec-5[37]等在血淋巴中高表達(dá)。肝胰腺和血淋巴是無脊椎動(dòng)物重要的免疫組織器官[38-40]，高表達(dá)的C型凝集素可以幫助機(jī)體快速識別和清除入侵的非己成分[34-41]，這與C型凝集素是免疫系統(tǒng)的重要組成成分是一致的。

研究證實(shí)C型凝集素在軟體動(dòng)物先天性免疫中發(fā)揮多種重要功能。海灣扇貝(A.irradians)的AiCTL-7能夠凝集細(xì)菌和紅細(xì)胞[42]，櫛孔扇貝(C.farreri)的CfLec-5可以凝集畢赤酵母(Pichiapastoris)[43]；櫛孔扇貝(C.farreri)的CfLec-1、CfLec-2、CfLec-3和CfLec-4都能促進(jìn)血細(xì)胞吞噬大腸桿菌(Escherichiacoli)[44-47]；海灣扇貝(A.irradians)的AiCTL-9和櫛孔扇貝(C.farreri)的CfLec-3可以促進(jìn)血淋巴細(xì)胞對瓊脂糖球的包囊作用[44,48]。有趣的是，最近在美洲牡蠣(Crassostreavirginica)中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)在消化器官中高表達(dá)的C型凝集素基因CvML3912和CvML3914，它們可以在牡蠣攝食過程中幫助進(jìn)行食物分選，而其是否具免疫功能尚不明確，需要進(jìn)一步研究[49]。

2 海洋節(jié)肢動(dòng)物C型凝集素研究現(xiàn)狀

C型凝集素在海洋節(jié)肢動(dòng)物中的研究主要集中在對蝦中。之前有綜述從對蝦C型凝集素的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式、免疫功能等方面進(jìn)行過總結(jié)[50]。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合近幾年的研究成果我們對海洋節(jié)肢動(dòng)物C型凝集素的研究進(jìn)行進(jìn)一步總結(jié)。

對蝦中含有一個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域的C型凝集素最為常見，僅有部分C型凝集素含有兩個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域，至今尚未發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)以上糖識別結(jié)構(gòu)域的C型凝集素[51]。大部分C型凝集素都含有信號肽，表明這些C型凝集素可能作為分泌性蛋白發(fā)揮作用[50]。

海洋節(jié)肢動(dòng)物C型凝集素的表達(dá)模式相類似，大部分C型凝集素在免疫組織器官中的表達(dá)量明顯高于其他組織器官[51-55]。日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus)的Leulectin[52]和MjLTL12[53]、墨吉明對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)的FmLC3等在肝胰腺中的表達(dá)量較高[54]；中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)的Fclectin特異性表達(dá)在血細(xì)胞中[55]；此外，日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的MnCTL主要在鰓和胃部表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)量很低[56]。C型凝集素在免疫組織器官中的高表達(dá)提示其可能與對蝦先天性免疫存在密切關(guān)系。

已有研究結(jié)果表明在對蝦中C型凝集素參與多種免疫反應(yīng)，如凝集作用：除中國對蝦(F.chinensis)的FcLec6外，其余已報(bào)道的C型凝集素均具有凝集細(xì)菌的功能[50]；促吞噬作用：中國對蝦(F.chinensis)的 FcLec4在識別細(xì)菌后與血細(xì)胞膜中的β-整聯(lián)蛋白結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)吞噬體吞噬細(xì)菌[57]；抑菌作用：日本對蝦(M.japonicus)的MjHeCL通過維持抗菌肽的表達(dá)來抑制血淋巴中菌群的增殖[58]；參與信號通路傳遞：日本對蝦(M.japonicus)的MjCC-CL通過激活JAK/STAT信號通路調(diào)控抗菌肽的表達(dá)[59]，凡納濱對蝦(L.vannamei)中的LvCTL3、LvCTL4是NF-κB信號通路的下游基因并受其調(diào)控[60-61]。

3 海洋棘皮動(dòng)物C型凝集素研究現(xiàn)狀

關(guān)于海洋棘皮動(dòng)物C型凝集素的研究主要集中在海參綱動(dòng)物中。近幾年在仿刺參(Apostichopusjaponicus)中鑒定的幾個(gè)C型凝集素基因(AjCTL、AjCTL-1、AjCTL-2、SjL-1)在結(jié)構(gòu)上存在一定相似性，如都含有信號肽、一個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域以及識別甘露糖的EPN氨基酸基序[62-65]。但是在表達(dá)模式上卻存在較大差異，AjCTL在縱肌和腸中的表達(dá)量較高，AjCTL-1 在生殖腺中高表達(dá)，AjCTL-2在體腔中的表達(dá)量最高，而SjL-1則主要在本表和觸手中高表達(dá)[62-65]。在功能方面，AjCTL-2可以結(jié)合革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌[64]；SjL-1既不促進(jìn)對細(xì)菌的吞噬也不抑制細(xì)菌生長，而是分布在海參體表作為一道防線阻止細(xì)菌入侵[63]。

4 海洋脊索動(dòng)物C型凝集素研究現(xiàn)狀

C型凝集素在海洋尾索動(dòng)物(被囊動(dòng)物)中的研究相對較少，到目前為止僅在玻璃海鞘(Cionaintestinalis)中克隆出1條C型凝集素基因CiCD94-1，與脊椎動(dòng)物CD94是同源基因。CiCD94-1在結(jié)構(gòu)上較為特殊，缺乏鈣離子結(jié)合位點(diǎn)和EPN等經(jīng)典氨基酸基序。CiCD94-1在海鞘中執(zhí)行多種功能，如特異性結(jié)合LPS參與先天性免疫過程；在海鞘幼體神經(jīng)系統(tǒng)的特定位置表達(dá)，參與海鞘神經(jīng)系統(tǒng)的形成[66]。

文昌魚(Branchiostomaspp.)是海洋頭索動(dòng)物的典型代表，基因組搜索佛羅里達(dá)文昌魚(Branchiostomafloridae)發(fā)現(xiàn)有1 200多個(gè)C型凝集素候選基因，是已知物種中數(shù)量最多的[67]。然而截至目前僅在白氏文昌魚(Branchiostomabelcheri)和日本文昌魚(Branchiostomajaponicum)中鑒定出4個(gè)C型凝集素基因，而相關(guān)研究也主要集中在特征描述方面，剩余的大量序列是否編碼真正的C型凝集素還有待進(jìn)一步研究。所克隆的四個(gè)基因在結(jié)構(gòu)上存在一定的相似性，如糖識別結(jié)構(gòu)域都位于羧基端，在氨基端都含有信號肽，表明這4個(gè)C型凝集素可能作為分泌性蛋白發(fā)揮作用[68-69]。這4個(gè)C型凝集素和海鞘的CiCD94-1不同，它們都含有C型凝集素鈣離子結(jié)合位點(diǎn)和保守的氨基酸基序[68-69]。這些C型凝集素在多個(gè)組織中均有表達(dá)，如AmphiCTL1和AmphiCTL2在成年文昌魚各組織中均有表達(dá)，但在肝盲囊和腸中的表達(dá)量最高；BjCTL在多個(gè)組織中有表達(dá)，其中在脊索和卵巢中的表達(dá)量較高；AmphiCTL3在皮膚、卵巢、小腸、肌肉、鰓、脊索和肝盲囊等組織中表達(dá)[68-69]。文昌魚C型凝集素基因的轉(zhuǎn)錄受病原微生物刺激調(diào)控，當(dāng)受到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母聚糖或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)特異性刺激后AmphiCTL1會上調(diào)70～400倍，而對副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)幾乎沒有反應(yīng)；當(dāng)受到細(xì)菌或細(xì)菌細(xì)胞壁成分刺激后AmphiCTL2和AmphiCTL3的表達(dá)量會上調(diào)5～20倍；當(dāng)受到大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)刺激后BjCTL的表達(dá)會被上調(diào)，這些結(jié)果提示文昌魚C型凝集素可能參與免疫反應(yīng)[68-69]。此外，AmphiCTL1和BjCTL還具有凝集細(xì)菌和抑制細(xì)菌生長的作用[68-69]。

5 海洋脊椎動(dòng)物C型凝集素研究現(xiàn)狀

海洋魚類是海洋脊椎動(dòng)物的重要組成部分。雖然海洋魚類種類繁多，但是關(guān)于C型凝集素的研究主要集中在一些具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋魚類中。之前已有綜述對魚類C型凝集素研究現(xiàn)狀進(jìn)行過總結(jié)[70]。本文將在此基礎(chǔ)上對海洋魚類C型凝集素研究進(jìn)展進(jìn)行簡述。海洋魚類C型凝集素主要在免疫組織器官中高表達(dá)，如大黃魚(Larimichthyscrocea)的LycCTLR在肝臟中的表達(dá)量較高[71]；大西洋鱈魚(Gadusmorhua)的Nlp在頭腎、肝和脾中高表達(dá)[72]；牙鲆(Paralichthysolivaceus)JFCTL的僅在肝臟轉(zhuǎn)錄[73]。近幾年鑒定的海洋魚類C型凝集素的功能主要集中在識別病原微生物、凝集細(xì)菌、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖等方面。如許氏平鲉(Sebastesschlegelii) 的SsCTL4具有結(jié)合細(xì)菌和病毒的特性，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌活性[74]；大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的SmLec1可以刺激淋巴細(xì)胞增殖和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺菌活性[75]。

6 總結(jié)和展望

我們對處于不同分類地位的海洋生物C型凝集素的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。目前鑒定的海洋生物C型凝集素主要分布在免疫組織器官中，如海洋無脊椎動(dòng)物在肝胰腺、血淋巴和一些與外界直接接觸的組織器官中表達(dá)量較高，在脊椎動(dòng)物中C型凝集素主要分布在肝臟、脾臟等免疫器官中(見表1)。其功能主要表現(xiàn)為識別和結(jié)合病原微生物、促凝集、促吞噬和包囊化、抑菌和抗病毒、參與信號通路傳遞等(見表1)。

C型凝集素?cái)?shù)目種類較多，基于序列同源性的系統(tǒng)演化分析對于海洋生物C型凝集素的研究具有重要意義。然而C型凝集素序列并不保守，而且部分海洋生物中C型凝集素?cái)?shù)量較多，結(jié)構(gòu)多樣，即使結(jié)合共線性分析等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)也不能確定大部分海洋動(dòng)物C型凝集素在高等脊椎動(dòng)物中的直線同源基因。如何對海洋生物中多種不同物種的C型凝集素進(jìn)行可信的系統(tǒng)演化分析并分類是個(gè)難題，也是今后海洋生物C型凝集素研究的一個(gè)重要研究方向。

表1 海洋生物C型凝集素組織分布及功能Table 1 Tissue distribution and immune function of C-type lectin in marine organisms

目前海洋生物C型凝集素更多集中于體外表達(dá)蛋白的功能研究，而對它們在體內(nèi)執(zhí)行的功能所知甚少。在對蝦中，生化和RNAi等技術(shù)的結(jié)合闡明了部分C型凝集素的體內(nèi)功能和作用機(jī)制[76]。然而大部分海洋生物C型凝集素結(jié)合的特異配體、介導(dǎo)的免疫信號通路，執(zhí)行的具體功能及作用機(jī)制等研究極度缺乏，是海洋生物C型凝集素研究亟需解決的問題。隨著CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的日益發(fā)展，必將極大推動(dòng)海洋生物C型凝集素的研究。