姚宇 王文軍 梁玉靈

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性的、進展的以進行性呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)的纖維性間質(zhì)性肺疾病[1]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation protein 1,Hrd1),又名synoviolin，是一種E3泛素連接酶，它廣泛的參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑，具有抑制Nrf2的表達、促進Ⅰ型膠原成熟與分泌的作用[2-4]。Ⅰ型膠原是肺組織發(fā)生纖維化的主要膠原纖維之一，構(gòu)成了細胞外基質(zhì)[5]。Nrf2則是機體抗氧化反應(yīng)的重要分子，其含量的降低而引起整個氧化/抗氧化反應(yīng)的失衡是肺纖維化的發(fā)病機制之一[6]。因此Hrd1可能在肺纖維化炎癥期及纖維化期同時起作用并成為潛在的治療靶點。本實驗利用LS-102干預(yù)大鼠肺纖維化模型，檢測Hrd1的表達及其與Ⅰ型膠原、Nrf2的關(guān)系以初步探究其在肺纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD雄性大鼠60只，6～8周齡，體重(230±40)g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2018-17。本動物實驗通過西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審查(受理號20181221002)。注射用鹽酸博來霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號17001711)。兔抗大鼠Hrd1、Nrf2多克隆抗體(ProteinTech中國分公司),兔抗大鼠Ⅰ型膠原、TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，LS-102(美國Merckmillipore公司),DMSO溶液(美國Sigma公司)，HE、Masson染色試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。病理圖文分析系統(tǒng)(Olympus)。

1.2 動物模型的制備、處理及分組 將60只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、溶劑組、LS-102組，每組15只。用2%戊巴比妥鈉麻醉后，除對照組外緩慢注射博來霉素溶液(5 mg/kg)制備肺纖維化模型，對照組氣管內(nèi)注射等體積0.9%氯化鈉溶液，LS-102組根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，于造模后予以腹腔注射LS-102溶液(1 mg/kg)，溶劑組、對照組和模型組同時予以腹腔注射等體積DMSO溶液、0.9%氯化鈉溶液。各組于實驗后每日腹腔注射等體積上述藥物至大鼠被處死。分別于造模后第7天、第14天、第28天每組隨機各處死5只大鼠。

1.3 肺系數(shù)的計算 4組大鼠處死前稱重，取肺組織后鈍性分離周圍組織及血凝塊后，予以0.9%氯化鈉溶液沖洗至組織變白，用紗布輕柔地吸干水分，稱肺濕重，以公式計算肺系數(shù)：肺濕重(g)/動物重量(g)×100。

1.4 肺組織病理學(xué)變化 4組大鼠肺組織于10%中性甲醛固定24 h后，予以石蠟包埋切片并行HE染色、Masson染色。運用ImagePro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，HE染色選取炎性最明顯的5個中倍鏡視野(×200)計算炎性細胞的數(shù)量(盡量避開大血管、大氣管)。Masson染色顯示膠原纖維為藍色，細胞核為藍墨色，肌纖維、紅細胞為紅色，測定陽性區(qū)域的累積光密度(IOD)。計算每組炎性細胞數(shù)量的平均值及膠原纖維累積光密度(IOD)的平均值。

1.5 免疫組化檢測 采用ELPS法檢測各組大鼠肺組織Hrd1、Ⅰ型膠原、Nrf2的表達量。取大鼠肺組織固定后進行石蠟包埋并切片。按試劑盒說明書操作，主要步驟為脫蠟、水化，滅活內(nèi)源過氧化物酶、漂洗、抗原修復(fù)，加一抗(1∶100)4℃過夜、沖洗后加入二抗，蘇木素復(fù)染后脫水、干燥封片。以細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性反應(yīng)，顏色越深則表達越強。每個切片取隨機取5個高倍鏡陽性表達視野(×400)，利用ImagePro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定各目標(biāo)蛋白陽性細胞的累積吸光度值(IOD值)及相應(yīng)面積(Area)，計算平均吸光度值(MOD=IOD/Area)分別作為Hrd1、Ⅰ型膠原、Nrf2表達量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺系數(shù) 模型組大鼠在第7、14、28天肺系數(shù)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中LS-102組在第14、28天肺系數(shù)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。見表1。

表1 4組大鼠各時間點肺系數(shù)變化

2.2 4組肺組織病理學(xué)變化

2.2.1 肺組織肉眼觀察:第7、14、28天對照組處死大鼠肺組織呈粉紅色、組織彈性良好、表面光滑。第7天其余3組多于肺上葉可見大量暗紅色片狀出血，肺組織腫脹明顯、重量增加。第14天，模型、溶劑組、LS-102組大鼠肺組織仍有少許片狀出血灶，上葉肺組織出現(xiàn)皺縮，可見少量結(jié)節(jié)。第28天，模型、溶劑組肺組織顏色稍蒼白、質(zhì)地較硬，上葉肺組織皺縮明顯，表面凹凸不平，下葉可見輕度肺組織皺縮、少量結(jié)節(jié)。

2.2.2 光鏡下:光鏡觀察下，對照組大鼠各時間點肺泡結(jié)構(gòu)完整，均未見明顯炎性及纖維化表現(xiàn)，偶見大鼠肺泡周圍可見少許炎性細胞浸潤。模型組與溶劑組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)周圍可見大量炎性細胞浸潤，隨時間逐漸消退，均仍高于對照組。LS-102組大鼠肺組織僅第7天炎性細胞浸潤少于上述2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組與溶劑組肺組織在第14天出現(xiàn)較多膠原纖維沉積，逐漸增高，均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LS-102組第14天、28天膠原纖維沉積少于上述2組(P<0.05)。見圖1、2，表2、3。

圖1 4組大鼠肺組織HE染色動態(tài)變化(Masson×200)

圖2 4組大鼠肺組織Masson染色動態(tài)變化(Masson×200)

表2 4組大鼠肺組織炎性細胞數(shù)量比較

表3 4組大鼠肺組織膠原纖維IOD比較

2.3 大鼠肺組織免疫組化

2.3.1 肺組織中Hrd1的表達:與模型組及溶劑組相比，所有時間點LS-102組中Hrd1表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組第7天Hrd1表達達到峰值，以后逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 4組大鼠肺組織Hrd1 MOD比較

圖3 4組大鼠肺組織Hrd1免疫組化動態(tài)變化(IHC×400)

2.3.2 肺組織中Nrf2的表達:與模型組及溶劑組比較，第7天LS-102組中Nrf2表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組第7天Nrf2表達達到峰值，以后逐漸降低。見圖4，表5。

圖4 4組大鼠肺組織Nrf2免疫組化動態(tài)變化(IHC×400)

表5 4組大鼠肺組織Nrf2 MOD比較

2.3.3 肺組織中Ⅰ型膠原的表達:與模型組及溶劑組比較，第14天、28天LS-102組中Ⅰ型膠原表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組Ⅰ型膠原的表達在第14天明顯增加，在第28天達到高峰。見圖5，表6。

圖5 4組大鼠肺組織Ⅰ型膠原免疫組化動態(tài)變化(IHC×400)

表6 4組大鼠肺組織Ⅰ型膠原 MOD比較

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是慢性進展性致纖維化性的間質(zhì)性肺炎的一種特殊類型，其準(zhǔn)確的發(fā)病機制仍然不清楚[1]，預(yù)后極差。其整個發(fā)病過程可以大致分為炎癥期和纖維化期。通過抑制介導(dǎo)兩個時期的分子信號通路有望獲得有效的治療方法。Hrd1,是一種E3泛素連接酶，主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白降解。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)它可作為IRE1-XPB1信號通路的下游效應(yīng)物參與未折疊蛋白反應(yīng)而調(diào)控Nrf2、參與膠原的合成與成熟，參與了肝纖維化/肝硬化、腎纖維化的發(fā)病[2,3]。另有研究表明Hrd1通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的表達和成熟參與了外顯顯子-4缺陷的肺表面蛋白C所致的間質(zhì)性肺炎(家族性間質(zhì)性肺炎)的發(fā)病[4]。Nrf2是肺纖維化中早期炎癥期的重要保護因子[5]，Ⅰ型膠原是纖維化期的主要組分之一[6]。LS-102是Yagishita等[7,8]研究發(fā)現(xiàn)的Hrd1的高選擇性抑制劑。本研究在現(xiàn)有報道的基礎(chǔ)下，利用LS-102進一步探討Hrd1在博來霉素所致大鼠肺纖維化的作用。

本研究表明大鼠肺組織Hrd1的表達，在早期肺泡炎癥階段最高，以后逐漸下降，可能Hrd1主要參與大鼠肺纖維化炎癥階段有關(guān)。抑制Hrd1后，Nrf2表達增加，在肺泡炎階段(第7天)最明顯。與Wu等[3]研究結(jié)果相似。推測主要是因為Hrd1可能主要抑制早期炎癥階段的Nrf2表達，而后期Nrf2升高不明顯，可能肺纖維化過程中同時通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1等其他炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)通路抑制了Nrf2的生成。

既往研究發(fā)現(xiàn)Hrd1能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)，有降解未折疊蛋白的作用，進而起到細胞保護作用，并且Hrd1是未折疊蛋白反應(yīng)的三條主要通路之一的IRE1-XBP1的下游效應(yīng)物[9]。有研究證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其引起的未折疊蛋白反應(yīng)是廣泛參與了肺纖維化的發(fā)病過程[10]。結(jié)合本實驗研究結(jié)果，可能為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與肺纖維化的具體機制進行了一定的補充。氧化應(yīng)激反應(yīng)被證實參與肺纖維化的炎癥期發(fā)病過程[11]，而Nrf2相關(guān)通路是機體抗氧化通路中核心通路的，能對多種抗氧化因子產(chǎn)生促進作用[12]，而本研究結(jié)果提示Hrd1可能通過早期抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路而參與肺纖維化的發(fā)病。

本研究中，抑制Hrd1后，Ⅰ型膠原在第14、28天表達量明顯減少，提示Hrd1可能抑制促進Ⅰ型膠原的表達，與Li等[2]研究結(jié)果相近?？赡芘c直接促進其分

泌及成熟有關(guān)[4]，但具體機制仍需進一步探討。多項研究證實以Ⅰ型膠原等為主的細胞外基質(zhì)的沉積是在肺纖維化進程中起主要作用[6]，本實驗結(jié)果顯示Hrd1可能有促進Ⅰ型膠原表達而參與IPF發(fā)病過程。

我們的研究表明，博來霉素致肺纖維化大鼠肺組織中Hrd1大量表達，抑制Hrd1能減少Ⅰ型膠原的表達，增加Nrf2的早期表達。表明Hrd1可能通過促進Ⅰ型膠原表達及抑制Nrf2的生成參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，通過抑制Hrd1能減少纖維化期Ⅰ型膠原的沉積和增加炎癥期Nrf2的表達以激活體內(nèi)抗氧化通路，可能為抗肺纖維化藥物的研制提供新的靶點。