侯艷玢，閆依狄，孟鑫

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121000）

脂肪酸作為一種重要的化合物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等諸多方面，目前主要以動(dòng)、植物油脂為原料生產(chǎn)[1]，但存在油脂產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等缺陷，限制了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，已有多種微生物用于功能油脂的生產(chǎn)[2-4]。然而，微生物細(xì)胞內(nèi)總脂需采用傳統(tǒng)破壁、離心工藝獲得，若脂肪酸能以游離形式分泌到細(xì)胞外，可減少?gòu)?fù)雜的分離工藝。已有報(bào)道在E. coli中表達(dá)植物或內(nèi)源硫脂酶基因，可獲得游離脂肪酸[5-7]。植物硫脂酶基因（Thioesterase，PtFATB）可催化水解脂?；鵄CP，生成游離脂肪酸和ACP，解除由脂?；鵄CP導(dǎo)致的脂肪酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制中的反饋抑制作用，釋放游離脂肪酸[8]。E.coli硫酯酶（Thioesterase I，tesA）是水解長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A（C12～C18）形成游離脂肪酸的關(guān)鍵酶[9-10]。本研究在E. coli中分別表達(dá)植物來(lái)源和內(nèi)源的硫脂酶基因，將細(xì)胞內(nèi)形成的脂肪酸以游離形式分泌到細(xì)胞外，獲得產(chǎn)游離脂肪酸的工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E. coli K-12、pET30、E. coli BL21（DE3）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）組培苗由本實(shí)驗(yàn)室提供；Taq DNA polymerase，T4 DNA連接酶購(gòu)自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First strand cDNA Synthesis Kit，膠回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；PCR引物由上海生工公司合成；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。MyCycler Thermal Cycler PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)，Agilent 6897氣相色譜由Agilent公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

將-80 ℃甘油保存的E. coli K-12接種于LB液體培養(yǎng)基中[2]，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用于提取基因組DNA。

1.2.2 硫脂酶PtFATB基因的表達(dá)

用總RNA提取試劑盒提取擬南芥總RNA，并經(jīng)Revert Aid First strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以擬南芥cDNA為模板擴(kuò)增PtFATB基因序列，th-L：CATGCCATGGTTTTGAAGCTTTC GTGTAATGTGAC；th-R：CGCGGATCCTTAACTTG AAGGCTTCTTTCTCCAC。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物與pET30a(+)分別用NcoI/BamHI酶切，構(gòu)建表達(dá)載體pET-PtFATB，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌MX1。

1.2.3 硫脂酶tesA基因的表達(dá)

以E. coli K-12 DNA為模板擴(kuò)增tesA基因序列，tesA-L：CCGGAATTCATGAACTTCAACAATGTTTTCC，tesA-R：ACGCGTCGACTTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物和pET30a(+)分別經(jīng)NcoI/SalI酶切，構(gòu)建表達(dá)載體pET-tesA，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌MX22。

1.2.4 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組菌MX1、MX2分別接種至含50 mL 50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)液中，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h，超聲波破壁后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)。將重組菌MX1和MX22分別接種在M9基本培養(yǎng)基中，30 ℃誘導(dǎo)12 h后測(cè)定代謝產(chǎn)物?？傊坑糜坞x脂肪酸試劑盒測(cè)定，葡萄糖含量用生物傳感儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酯酶基因的擴(kuò)增和表達(dá)

重組質(zhì)粒pMX1和pMX22分別經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，目的片段成功插入到表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，獲得陽(yáng)性重組菌MX1和MX22（圖1和圖2所示）。

如圖3所示，SDS-PAGE電泳表明，兩種硫酯酶基因在E. coli中成功表達(dá)，均可見(jiàn)清晰的條帶，tesA基因表達(dá)產(chǎn)物約為28.9 KD，PtFATB基因表達(dá)產(chǎn)物約為45 KD，與預(yù)期結(jié)果一致，表明兩種硫酯酶基因已成功在E. coli中表達(dá)。

圖1 擬南芥硫脂酶基因的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒構(gòu)建

圖2 大腸桿菌硫脂酶基因的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒構(gòu)建

圖3 不同來(lái)源的硫脂酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)

2.2 硫脂酶基因功能比較

在E. coli中表達(dá)PtFATB和tesA后，獲得的胞外游離脂肪酸為33.53 mg/L和25.23 mg/L，為原始菌株的5～6倍，胞外游離脂肪酸與胞內(nèi)總脂比例為1∶5.8和1∶7.2，游離脂肪酸含量約占總脂的14.71%和12.13%。在天然E. coli中，脂肪酸合成與磷脂合成是緊密相聯(lián)的過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成的中間產(chǎn)物非常有限，脂酰ACP的大量積累會(huì)抑制脂肪酸合成。在硫脂酶水解作用下，可有效解除細(xì)胞內(nèi)的底物抑制現(xiàn)象，E. coli細(xì)胞內(nèi)形成的脂肪酸在硫脂酶水解作用下，釋放出游離脂肪酸。兩種硫脂酶基因功能驗(yàn)證如表1所示。

表1 兩種硫脂酶基因功能驗(yàn)證

3 結(jié)論

在E. coli中分別表達(dá)了擬南芥和內(nèi)源硫脂酶基因，兩者均能提高重組菌細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸水平，解除產(chǎn)物的反饋抑制作用，脂肪酸以游離形式分泌到外，胞外游離脂肪酸和胞內(nèi)總脂比例分別為1∶5.8和1∶7，占細(xì)胞總脂的14.7%和12.1%。