蔣鴻雁 曹 艷□ 李恒希 吳德野 楊方林 吳海鷹# 李 坪△

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系，昆明 650500；2 齊魯醫(yī)藥學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系，淄博 255213；3 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，昆明 650032）

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）內(nèi)約占成熟膠質(zhì)細(xì)胞的10%，是CNS固有的巨噬細(xì)胞和免疫監(jiān)視細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要執(zhí)行者[1]，一旦受到免疫原或內(nèi)毒素的刺激就會(huì)被激活，分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥因子[2]。這些炎癥介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生成為損害大腦的主要神經(jīng)毒素[3]，其中的 PGE2在炎癥早期反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在正常生理和病理狀態(tài)下，PGE2通過(guò)作用于靶細(xì)胞膜表面的4種G蛋白偶聯(lián)受體亞型（EP1、EP2、EP3和EP4）發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[4]，其中EP2受體與慢性炎癥和神經(jīng)退行性疾病的繼發(fā)性神經(jīng)毒性密切相關(guān)[5]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)記載了AH6809作為EP2受體抑制劑的應(yīng)用[6-8]，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，大部分僅做了AH6809對(duì)細(xì)胞活力的檢測(cè)，而未對(duì)其是否誘發(fā)細(xì)胞凋亡進(jìn)行探索。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）被廣泛應(yīng)用于激活和誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放致炎因子和一系列活性物質(zhì)，從而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用[9-10]。因此，本研究使用AH6809干預(yù)LPS激活的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2細(xì)胞[11]，通過(guò)免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL等檢測(cè)不同濃度AH6809干預(yù)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致BV-2細(xì)胞的凋亡情況。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物lectin-FITC、熒光二抗Cy3標(biāo)記羊抗兔多克隆IgG、一抗多克隆兔抗cleaved caspase-3和一抗鼠抗單克隆β-actin，購(gòu)于Sigma公司（美國(guó)）；10%胎牛血清，購(gòu)于Invitrogen公司（美國(guó)）；EP2受體拮抗劑AH6809，購(gòu)于Cayman公司（美國(guó)）；二抗為羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，購(gòu)于Pierce公司（美國(guó)）；TUNEL試劑盒購(gòu)于德國(guó)羅氏公司。

1.2 BV-2細(xì)胞培養(yǎng)

用含1%抗生素和10%FBS的DEME培養(yǎng)基，將BV-2細(xì)胞置于恒溫箱（37℃，含5%CO2）培養(yǎng)。每2 d更換培養(yǎng)液，當(dāng)BV-2細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用胰酶消化，傳代比例控制在1∶4，當(dāng)其密度達(dá)3×105/mL時(shí)接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、LPS組和LPS+AH6809干預(yù)組。此外LPS+AH6809組 在LPS（1 μg/L）作 用 下，各 滴加不同濃度梯度的AH6809，即10、20、30、40、80 μmol/L和160 μmol/L，然 后 再 孵 育24 h后 進(jìn)行分析，各組分別為：LPS+AH10、LPS+AH20、L P S+A H 3 0、L P S+A H 4 0、L P S+A H 8 0、LPS+AH160。用倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)各組BV-2細(xì)胞的形態(tài)、密度和貼壁狀況。

1.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)cleaved caspase-3表達(dá)

將制備好的細(xì)胞爬片用預(yù)冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液進(jìn)行固定（15 min），室溫下用5%羊血清封閉（1 h），滴加稀釋濃度為1∶200的兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體，將培養(yǎng)板放入濕盒中過(guò)夜（4℃）；加入稀釋濃度為1∶100的羊抗兔熒光二抗Cy3，室溫孵育1 h； PBS液沖洗后加入稀釋濃度為1∶300的lectin-FITC，室溫孵育1 h；同樣方法PBS液沖洗后，用稀釋比例為1∶50 000的DAPI復(fù)染細(xì)胞核；吸干爬片上的液體，用準(zhǔn)備好的熒光封片劑封片；將制備好的玻片用錫箔紙遮光，放在室溫下，待其干燥后，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和拍片。

1.4 TUNEL法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)；DAPI復(fù)染細(xì)胞核（10 min）；用PBS漂洗3次（每次5 min），熒光封片劑封片；室溫下用錫箔紙遮光進(jìn)行干燥，激光共聚焦顯微鏡采圖。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用0.25%胰酶充分消化BV-2細(xì)胞后吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液置于離心機(jī)離心，1 500 r/min，10 min；用預(yù)先準(zhǔn)備好的EP管收集離心后的BV-2細(xì)胞；用PBS洗滌2次，每次5 min，后用濃度為70%預(yù)冷乙醇固定；PBS洗滌2次，每次5 min，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL后，加入碘化丙啶染液充分搖勻；室溫下進(jìn)行避光染色，30 min，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；采用Cell Quest Pro收集所需實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并通過(guò)Mod Fit進(jìn)行分析。

1.6 免疫印跡檢測(cè)cleaved caspase-3蛋白含量

BV-2細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，置于離心機(jī)離心，4℃，13 000 r /min，25 min，收集上清；用含有蛋白酶抑制劑的試劑提取蛋白質(zhì)； SDS-PAGE電泳分離；通過(guò)半干法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液在室溫下封閉1 h；采用PBS漂洗3次，每次5 min，再滴入一抗，搖床孵育，4℃過(guò)夜；PBS漂洗后滴加二抗，搖床室溫孵育；暗室曝光并觀察結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性和正態(tài)檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)資料采用x±s表示，并采用單因素方差分析（one-way ANOVA）分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果及兩兩比較的SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BV-2細(xì)胞形態(tài)

正常狀態(tài)下，BV-2細(xì)胞呈現(xiàn)出靜息的形態(tài)特征，胞體較小，多呈圓形、橢圓形，偶見(jiàn)短小突起（圖1 A1、B1）。LPS 刺激后，可見(jiàn)BV-2細(xì)胞出現(xiàn)激活特征變化：大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞體大，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，胞體發(fā)出細(xì)而長(zhǎng)的突起（圖 1 A2、 B2）。加入干預(yù)的AH6809濃度在10、20、30、40 μmol/L時(shí)（圖 1 A3、B3），部分細(xì)胞的長(zhǎng)突起發(fā)生回縮，細(xì)胞體積變小、形態(tài)變圓（其中低濃度的10、20、30 μmol/L圖未展示）；當(dāng)濃度逐漸升高至80 μmol/L時(shí)，觀察到BV-2細(xì)胞的形態(tài)顯著改變（圖1 A4、B4），較多細(xì)胞的突起皺縮、變短，數(shù)量減少或者消失，外形趨于圓形，體積變??；當(dāng)AH6809濃度達(dá)到160 μmol/L時(shí)（圖1A5、B5），細(xì)胞輪廓模糊，染色質(zhì)深染、碎裂，細(xì)胞密度降低，可見(jiàn)空泡狀細(xì)胞。

圖1 倒置顯微鏡下BV-2細(xì)胞形態(tài)Fig 1 Morphological changes of BV-2 cells

2.2 BV-2細(xì)胞凋亡情況

BV-2細(xì)胞用綠色熒光進(jìn)行標(biāo)記，顯示紅色熒光則為凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明，正常對(duì)照組和LPS組未見(jiàn)凋亡細(xì)胞（圖2A1～A3， B1～B3，見(jiàn)封二）。LPS+AH6809（＜80 μmol/L）組可見(jiàn)cleaved caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞大小、形態(tài)趨于正常，陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖2C1～C3，見(jiàn)封二），但隨AH6809干預(yù)濃度上升至80 μmol/L，LPS+AH6809組BV-2細(xì)胞中cleaved caspase 3的形態(tài)變得不規(guī)則，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，突起變大、變粗，陽(yáng)性染色深，且主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖2D1～D3，E1-E3，見(jiàn)封二）。

TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，正常對(duì)照組和LPS組未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡（圖3A1～A3， B1～B3，見(jiàn)封二）。AH6809≤40 μmol/L時(shí)，偶見(jiàn)極個(gè)別BV-2細(xì)胞凋亡（圖3C1～C3，見(jiàn)封二）。AH6809≥80 μmol/L時(shí)，BV-2細(xì)胞的凋亡數(shù)目漸增，而當(dāng)AH6809濃度達(dá)160 μmol/L時(shí)，大面積BV-2細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖3D1～D3， E1～E3，見(jiàn)封二）。提示凋亡BV-2細(xì)胞的增多與AH6809的濃度呈正相關(guān)。

從流式細(xì)胞結(jié)果圖中觀察到正常對(duì)照組和LPS組BV-2細(xì)胞無(wú)凋亡發(fā)生（圖4A、B）。伴隨AH6809濃度的上升，BV-2細(xì)胞的凋亡數(shù)上升（P＜0.05）（圖4G），即AH6809的濃度低于80 μmol/L時(shí)（圖4C、D），BV-2細(xì)胞凋亡數(shù)目極少；AH6809濃 度 超 過(guò)80 μmol/L（含80 μmol/L）時(shí)，BV-2細(xì)胞凋亡數(shù)目增多明顯（圖4E）；濃度達(dá)160 μmol/L時(shí)（圖4F），BV-2細(xì)胞凋亡達(dá)高峰。

2.3 Cleaved caspase-3表達(dá)情況

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，在AH6809干預(yù)濃度40 μmol/L時(shí)，cleaved caspase-3蛋白條帶略開(kāi)始出現(xiàn)，濃度達(dá)80 μmol/L時(shí)條帶漸明顯，濃度為160 μmol/L時(shí)條帶最為明顯（圖5A）。通過(guò)對(duì)條帶圖進(jìn)行灰度值測(cè)量和分析，與LPS組相比，當(dāng)AH6809濃度在80 μmol/L以上時(shí)，差異開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5B）。

蔣鴻雁等. EP受體拮抗劑AH6809對(duì)炎癥導(dǎo)致的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞起源于神經(jīng)外胚層，當(dāng)CNS受到損害時(shí)，靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活，持續(xù)釋放TNF-α、IL-1β和PGE2等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞毒性物質(zhì)，引發(fā)神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，繼而損傷周?chē)窠?jīng)元，受損的神經(jīng)元又會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的活化，導(dǎo)致神經(jīng)性炎癥進(jìn)行性加重[12-13]。本研究通過(guò)倒置顯微鏡觀察，正常狀態(tài)下的BV-2細(xì)胞外形呈上皮細(xì)胞樣，胞體和核較小，呈圓形，偶見(jiàn)有突起；LPS刺激后處于炎癥狀態(tài)的BV-2細(xì)胞，胞體肥大，核大而圓，長(zhǎng)出分枝樣突起；突起向細(xì)胞兩極延長(zhǎng)、呈紡錘樣改變，同時(shí)出現(xiàn)BV-2細(xì)胞突起之間互相連接的現(xiàn)象，這與聶永慧等[14-15]對(duì)病理狀態(tài)下BV-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)報(bào)道具有相似性。課題組前期研究結(jié)果顯示，AH6809對(duì)BV-2細(xì)胞TNF-α、IL-1β表達(dá)具有抑制作用，AH6809有干預(yù)減輕炎癥反應(yīng)的效用[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示梯度濃度增高的AH6809在抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中，BV-2細(xì)胞出現(xiàn)突起變短、變粗，細(xì)胞胞體變圓和變小等變化，和小鼠腹腔內(nèi)注射LPS 1周后出現(xiàn)的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化近似[16]，推測(cè)BV-2細(xì)胞形狀的變化與AH6809減輕炎癥反應(yīng)有一定的聯(lián)系。課題組前期研究顯示，AH6809干預(yù)后TNF-α、IL-1β、mPGES-1等出現(xiàn)低表達(dá)， BV-2細(xì)胞發(fā)生類(lèi)似于炎癥反應(yīng)減輕的形狀轉(zhuǎn)歸，進(jìn)一步推測(cè)可能與AH6809干預(yù)后炎癥反應(yīng)減輕有一定關(guān)系[2，8，17]。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組（A）、LPS組（B）和LPS + AH6809干預(yù)組（C～F）的BV-2細(xì)胞的凋亡率及其條形圖（G）顯示，隨著AH6809濃度增加，凋亡率增加，△P＜0.05 vs 對(duì)照組BV-2細(xì)胞Fig 4 The apoptosis rate of BV-2 cells in control group（A）， LPS group（B） and LPS+AH6809 （C～F）.Bar graph （G） showed the apoptosis rate of BV-2 cells increased following the increasing concentration of AH6809，△P＜0.05 vs control group

同樣，在前期研究中AH6809對(duì)BV-2細(xì)胞是否致凋亡的實(shí)驗(yàn)顯示，AH6809在40 μmol/L以上時(shí)，BV-2細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡跡象；隨著AH6809濃度的遞增，凋亡的BV-2細(xì)胞呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢(shì)，表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性特征[21]。異常凋亡往往會(huì)誘發(fā)各種疾病，如自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等。而本研究利用BV-2細(xì)胞株，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探索BV-2細(xì)胞的凋亡對(duì)神經(jīng)退行性疾病的影響和可能機(jī)制具有重要意義[22]。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，當(dāng)AH6809抑制炎癥反應(yīng)的濃度＜80 μmol/L時(shí)，鏡下BV-2細(xì)胞中的cleaved caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的大小、形態(tài)趨于正常，陽(yáng)性染色主要位于胞質(zhì)；當(dāng)濃度≥80 μmol/L時(shí)，可見(jiàn)BV-2細(xì)胞變圓，胞質(zhì)內(nèi)溶酶體顆粒明顯增多，胞質(zhì)濃縮甚至最終消失，核內(nèi)染色質(zhì)深染、濃縮邊聚，核仁裂解，核固縮等凋亡跡象出現(xiàn)；當(dāng)濃度為160 μmol/L時(shí)，觀察區(qū)域出現(xiàn)核溶解及大量空泡狀細(xì)胞，以及與周?chē)?xì)胞分離等密集凋亡現(xiàn)象，這與谷氨酸誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)改變相似[18]，說(shuō)明伴隨AH6809在抗炎時(shí)的干預(yù)濃度的升高也會(huì)導(dǎo)致BV-2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。類(lèi)似地，用PGE2干預(yù)后，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人乳頭瘤病毒E5轉(zhuǎn)染的C-33A宮頸癌細(xì)胞凋亡減少，而AH6809使用后增加了細(xì)胞凋亡；此外，有研究報(bào)道用PGE2預(yù)處理人類(lèi)白血病HL-60細(xì)胞，PGE2通過(guò)EP2激活Ras-Raf-ERK途徑，清除ROS，增加細(xì)胞谷胱甘肽水平和降低脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制甲萘醌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，AH6809干預(yù)后，這種抑制作用受到逆轉(zhuǎn)[19-20]。

圖5 免疫印跡檢測(cè)不同濃度AH6809干預(yù)后cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)Fig 5 The expression of cleaved caspase-3 protein after different concentrations of AH6809 intervention was detected by Western blotting

以上研究均表明AH6809在不同的細(xì)胞研究中，會(huì)對(duì)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生一定的影響，但是出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的濃度存在一定的差異[21]。本研究中，檢測(cè)使用不同濃度的AH6809在抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)時(shí)，BV-2細(xì)胞的凋亡情況顯示，僅當(dāng)AH6809濃度≥80 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；當(dāng)AH6809濃度達(dá)160 μmol/L時(shí)，可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞。因此推測(cè)，AH6809在抑制炎癥反應(yīng)的同時(shí)，隨著濃度的增高會(huì)誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的凋亡，且當(dāng)濃度≥80 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)與濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)增多的現(xiàn)象，而國(guó)外關(guān)于AH6809引起基質(zhì)細(xì)胞22B和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12Z凋亡的濃度為75 μmol/L[23-24]。于是有學(xué)者指出，采用LPS刺激二甲雙胍處理RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，評(píng)估它們對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，LPS可以強(qiáng)烈抑制AMP蛋白激酶激活，進(jìn)而干擾其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，推測(cè)與LPS抑制細(xì)胞周期，阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sub-G1，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡[25]。而本實(shí)驗(yàn)中LPS誘發(fā)炎癥后使用AH6809進(jìn)行干預(yù)，其引起細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的濃度也相對(duì)較高[21]。

綜上所述，AH6809在體內(nèi)外的應(yīng)用中，有抑制炎癥反應(yīng)的作用，也在一定程度上對(duì)細(xì)胞有致凋亡影響，因此在使用AH6809抑制炎癥反應(yīng)的同時(shí)，需要考慮到AH6809濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)染色共聚焦圖像顯示BV-2細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白的免疫陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)尺=50 μm。A：對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+AH40組；D：LPS+AH80組；E：LPS+AH160組。A1～E1：不同分組細(xì)胞形態(tài)；A2～E2：cleaved caspase-3凋亡蛋白；A3～E3：Lectin標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞與cleaved caspase-3融合，DAPI復(fù)染細(xì)胞核.

圖3 BV-2細(xì)胞TUNEL染色顯示LPS+AH6809增加TUNEL+細(xì)胞數(shù)（C2～E2）。TUNEL+細(xì)胞被標(biāo)記為綠色，標(biāo)尺=50 μm。A：對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+AH40組；D：LPS+AH80組；E：LPS+AH160組。A1～E1：不同分組細(xì)胞形態(tài)；A2～E2：TUNEL染色；A3～E3：DAPI復(fù)染細(xì)胞核.

Explanation of figures（see inside front cover）

Fig 2 Confocal images showing the immunoreactivities of cleaved caspase-3 protein in BV-2 cells by double-labeling immunofluorescence staining，bar=50 μm. A： Control group； B： LPS group； C： LPS+AH40 group； D：LPS+AH80 group； E： LPS+AH160 group. A1-E1： Cell morphology of different groups； A2-E2： Cleaved caspase-3 apoptotic protein；A3-E3： Lectin-labeled microglial cells were fused with cleaved caspase-3， and DAPI counterstained nuclei.

Fig 3 TUNEL staining of BV-2 cells showed that LPS+AH6809 increased the number of TUNEL+cells （C2-E2）. TUNEL+cells were labeled green，bar=50 μm. A： Control group；B： LPS group； C： LPS+AH40 group；D： LPS+AH80 group； E： LPS+AH160 group. A1-E1： Cell morphology of different groups； A2-E2： TUNEL staining； A3-E3： DAPI counterstained nuclei.