于紅艷，張昕欣，婁 歡，王蘇玲

(1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.臺(tái)州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，浙江 臺(tái)州 318000)

對(duì)羥基苯甲酸是重要的有機(jī)合成原料，也是對(duì)羥基甲苯、聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等多種芳香化合物生物代謝的中間產(chǎn)物[1]，廣泛應(yīng)用于化工、塑料、食品、醫(yī)藥及染料工業(yè)中[2]。近年來(lái)不斷有研究指出，對(duì)羥基苯甲酸具有雌激素活性[3]，它們通過(guò)各種途徑進(jìn)入環(huán)境[4]，對(duì)水體、土壤和大氣造成污染，并逐漸威脅到人類健康[5]。由于對(duì)羥基苯甲酸具有很強(qiáng)的抑菌作用，所以對(duì)對(duì)羥基苯甲酸污染的修復(fù)特別是生物修復(fù)具有較大的難度[6-7]。對(duì)羥基苯甲酸降解菌株的好氧降解途徑主要包括:鄰位途徑[8]、間位途徑[8]、龍膽酸途徑[9]和原兒茶酸途徑。目前已知的菌株對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解速率及降解效率不甚理想[10-11]，菌株在降解對(duì)羥基苯甲酸時(shí)的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)量變化也未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

作者采用平板劃線法從臺(tái)州市某印染廢水中篩選高效對(duì)羥基苯甲酸降解菌株，對(duì)其形態(tài)及生理生化特性進(jìn)行分析，用cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法對(duì)其純培養(yǎng)和對(duì)羥基苯甲酸脅迫的基因進(jìn)行比較分析，查找降解對(duì)羥基苯甲酸的調(diào)控基因并推測(cè)降解途徑，以期為對(duì)羥基苯甲酸污染的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與培養(yǎng)基

對(duì)羥基苯甲酸，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，用丙酮配成1.0 g·L-1的母液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾除菌，備用；其它試劑均為分析純。

葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硫酸銨0.2%，檸檬酸鈉0.1%，七水合硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，蛋白胨0.1%，葡萄糖0.2%，pH值7.2。

對(duì)羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基：硫酸銨0.2%，檸檬酸鈉0.1%，七水合硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，蛋白胨0.1%，pH值7.2；滅菌后加入對(duì)羥基苯甲酸丙酮母液，使終濃度為200 mg·L-1。

1.2 菌株的篩選與分離

取適量某印染廢水作為菌源水體，置于葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中25 ℃搖床培養(yǎng)3 d；取富集培養(yǎng)液1 mL接種于對(duì)羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基中，于25 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d；將培養(yǎng)物稀釋涂布于固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)至有肉眼可見(jiàn)的明顯菌落長(zhǎng)出；在固體無(wú)機(jī)鹽平板上連續(xù)劃線轉(zhuǎn)板3次，挑取菌落大、生長(zhǎng)較快的單菌株接入對(duì)羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基斜面，4 ℃保存，備用。

1.3 菌株的鑒定

參照Barnett法[12]對(duì)篩選出的菌株的形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定，參照Ebada法[13]對(duì)篩選出的菌株的生理生化特性進(jìn)行鑒定。

1.4 菌株的cDNA文庫(kù)構(gòu)建和基因測(cè)序

將篩選出的菌株在LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)至OD600=1；離心，收集菌體，分別重懸于等體積的對(duì)羥基苯甲酸脅迫培養(yǎng)基與葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)72 h；離心，收集菌體，采用TRIzol法(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA[14]。以5 μg總RNA起始量建庫(kù)，采用TruSeq RNA文庫(kù)制備試劑盒(Illumina)構(gòu)建文庫(kù)，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)；cBot上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，生成clusters；在Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行2×100 bp測(cè)序[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)與生理生化特性

經(jīng)過(guò)分離純化，得到一株能以對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源(200 mg·L-1)生長(zhǎng)的菌株。該菌株的菌落特征為：圓形，白色，表面光滑，邊緣齊整；生理生化特性為：細(xì)胞呈卵圓形，革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢，出芽生殖。

菌株經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，選擇同源性大于97%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株與克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)的同源性最高，結(jié)合菌株形態(tài)、菌落特征及生理生化特性，鑒定為克雷白氏桿菌，命名為K.pneumoniaeTzyx1。

2.2 K.pneumoniae Tzyx1降解對(duì)羥基苯甲酸的調(diào)控基因及降解途徑

根據(jù)K.pneumoniaeTzyx1 unigenes功能注釋分析結(jié)果[16]，推測(cè)K.pneumoniaeTzyx1對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解途徑如圖1所示，涉及對(duì)羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因有8個(gè)，列于表1。

圖1 K.pneumoniae Tzyx1對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解途徑

表1 K.pneumoniae Tzyx1中涉及對(duì)羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因

根據(jù)注釋結(jié)果，K.pneumoniaeTzyx1至少存在1種完整的KEGG pathway記錄的苯環(huán)開(kāi)環(huán)方式，是在單加氧酶(p-hydroxybenzoate 3-monooxygenase)的作用下在對(duì)羥基苯甲酸的3位引入一個(gè)羥基將其轉(zhuǎn)化生成原兒茶酸，原兒茶酸擁有鄰二醇結(jié)構(gòu)，可以被雙加氧酶開(kāi)環(huán)。之后，在原兒茶酸3,4-雙加氧酶(protocate-chuate 3,4-dioxygenase)的作用下內(nèi)開(kāi)環(huán)生成3-羧基粘康酸。這些開(kāi)環(huán)產(chǎn)物在一系列水解酶、水合酶和醛縮酶的作用下，經(jīng)過(guò)反應(yīng)代謝為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)(圖1)。

2.3 K.pneumoniae Tzyx1降解對(duì)羥基苯甲酸的其它基因(表2)

表2 K.pneumoniae Tzyx1降解對(duì)羥基苯甲酸的其它基因

表2列出了K.pneumoniaeTzyx1中可能參與苯環(huán)開(kāi)環(huán)后的降解、但不參與上述代謝途徑的其它基因。如脫羧酶(4-carboxymuconolactone decarboxylase)，其催化對(duì)羥基苯甲酸的脫羧反應(yīng)生成苯酚[17]，苯酚在苯酚單加氧酶的催化下轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚；又如CoA連接酶，其可以催化對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成4-羥基苯甲酰-CoA。由此推斷K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它未報(bào)道的參與苯環(huán)開(kāi)環(huán)的基因，也有可能存在其它未報(bào)道的苯環(huán)開(kāi)環(huán)方式。

3 結(jié)論

K.pneumoniaeTzyx1涉及對(duì)羥基苯甲酸原兒茶酸代謝途徑的調(diào)控基因有8個(gè)，存在至少一種完整的KEGG pathway記錄的苯環(huán)開(kāi)環(huán)方式，原兒茶酸代謝途徑的起始化合物為有取代基團(tuán)的芳烴類化合物。同時(shí)，K.pneumoniaeTzyx1可以降解無(wú)取代基團(tuán)的芳烴類化合物，且存在一些參與其它苯環(huán)開(kāi)環(huán)降解途徑的下游基因。因此，K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它芳烴化合物的降解途徑，如脫碳酸途徑和苯甲酰-CoA還原途徑。