賈嘯靜，楊尚天

(1.華北制藥華勝有限公司 河北省工業(yè)企業(yè)試驗(yàn)研究中心，河北 石家莊 052160；2.美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系，俄亥俄 43221)

鏈霉素(Streptomycin)是一種常見(jiàn)的氨基糖苷類(lèi)抗生素[1]，由灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)發(fā)酵產(chǎn)生。鏈霉素曾經(jīng)是抗結(jié)核治療的首選藥物[2]，由于耳毒性副作用[3]，其應(yīng)用大大受限。近年來(lái)隨著農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展，鏈霉素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)方面的需求逐漸增加。目前，鏈霉素的通用生產(chǎn)方法為液體深層攪拌發(fā)酵，該方法會(huì)產(chǎn)生較大的菌體量，給后期處理帶來(lái)一定的困難，加上廢棄菌體處理、廢水排放等環(huán)保成本的增加對(duì)鏈霉素生產(chǎn)企業(yè)造成了很大的壓力，迫切需要尋找高效的鏈霉素生產(chǎn)方法。

纖維床生物反應(yīng)器(fibrous-bed bioreactor，F(xiàn)BB)是由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)楊尚天教授在傳統(tǒng)填充床反應(yīng)器(packed-bed reactor，PBR)基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)明的一種新型生物反應(yīng)器。該反應(yīng)器選用棉質(zhì)纖維作為固定化載體，具有無(wú)毒無(wú)害、孔隙率高(>95%)、比表面積大(>40 m2·m-3)、細(xì)胞載量高、不影響細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于丙酸、丁酸等有機(jī)酸發(fā)酵以及動(dòng)物細(xì)胞高密度培養(yǎng)等領(lǐng)域[4-5]。近年來(lái)隨著生物發(fā)酵技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)BB的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。Xu等[6]成功將短密青霉固定在旋轉(zhuǎn)FBB上發(fā)酵生產(chǎn)霉酚酸，并達(dá)到了14 d 5.7 g·L-1的水平。

基于此，作者將FBB應(yīng)用于鏈霉素發(fā)酵生產(chǎn)，利用纖維床反應(yīng)器固定灰色鏈霉菌，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源進(jìn)行優(yōu)化，并與傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵進(jìn)行比較，以期建立一套適用于鏈霉素固定化發(fā)酵生產(chǎn)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

StreptomycesgriseusB-IC91，由美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(NRRL)提供。

平面培養(yǎng)基(g·L-1)：可溶性淀粉10，K2HPO41，MgSO4·7H2O 1，NaCl 1，(NH4)2SO42，CaCO32，微量元素(1 L中FeSO4·7H2O 1 g，MnCl2·4H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 1 g)0.1 mL，瓊脂15，pH值 7.2～7.4；培養(yǎng)7～9 d。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10，黃豆粉3，KH2PO40.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，CaCO35，pH值 7.0；28 ℃培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖40，黃豆粉30，淀粉10，(NH4)2SO46，NaCl 2，MgSO4·7H2O 1，CaCO35，pH值7.0；28 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2 發(fā)酵裝置

FBB由一個(gè)1 L的玻璃攪拌式發(fā)酵罐和一根直徑80 mm、高300 mm的雙層玻璃柱纖維床反應(yīng)器組成。纖維床反應(yīng)器內(nèi)由一條18 cm×18 cm的100%棉質(zhì)毛巾與一張約25 cm×25 cm的交聯(lián)鋼絲網(wǎng)組成，二者疊放并卷成圓筒狀，置于玻璃柱內(nèi)。纖維床反應(yīng)器通過(guò)上下2根乳膠管與發(fā)酵罐連通，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵泵入纖維床反應(yīng)器內(nèi)，與纖維床充分接觸吸附后，發(fā)酵液從上端乳膠管回流至發(fā)酵罐內(nèi)，完成物料的交換和循環(huán)。

1.3 鏈霉素的分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精確稱(chēng)取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用純水稀釋配制成10 000 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，稀釋成200 U·mL-1、400 U·mL-1、600 U·mL-1、800 U·mL-1和1 000 U·mL-1的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取各濃度鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL于試管中，再加入2.5 mL水、1滴4%鹽酸羥胺、0.5 mL 2 mol·mL-1NaOH溶液，搖勻后置于沸水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，再加入0.5%硫酸鐵銨試劑10 mL，搖勻，靜置5 min，測(cè)定520 nm處吸光度，測(cè)定3次，取平均值。以吸光度為橫坐標(biāo)、鏈霉素效價(jià)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合得到線(xiàn)性回歸方程[7]。

1.3.2 發(fā)酵液效價(jià)的計(jì)算

吸取稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液于離心管中，用1∶2硝酸將發(fā)酵液酸化至pH值約為3，于8 000 r·min-1離心10 min；吸取上清液2.5 mL兩份，分別置于2支試管中，向其中一支試管中加入4%鹽酸羥胺1滴作為空白對(duì)照；按1.3.1方法測(cè)定520 nm處吸光度，代入回歸方程，計(jì)算上清液效價(jià)；再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算發(fā)酵液效價(jià)。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基中主要有機(jī)氮源黃豆粉含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和油脂，是造成培養(yǎng)基黏稠和產(chǎn)生泡沫的主要原因。為了讓菌絲更有效地附著在FBB的纖維床上，需要尋找能夠替代黃豆粉的氮源。因此，分別以黃豆粉、黃豆粉濾液(煮沸后過(guò)濾)、大豆蛋白胨、黃豆粉濾液+大豆蛋白胨為培養(yǎng)基氮源，比較發(fā)酵效果，確定最優(yōu)氮源。

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)如下(g·L-1)：KH2PO40.65，(NH4)2SO48，NaCl 2.5，黃豆粉36(其它氮源以相同質(zhì)量比計(jì)算)，葡萄糖65～85。

1.5 FBB發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素

將種子液按接種量10%接種于裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，于28 ℃通氣攪拌培養(yǎng)24 h后，連接纖維床反應(yīng)器，將發(fā)酵液泵入，并開(kāi)啟恒溫裝置，控制溫度為28 ℃。待菌體吸附完全后，視情況向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充新鮮料液。監(jiān)測(cè)菌體量、pH值、鏈霉素效價(jià)等參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)

從圖1可知，線(xiàn)性回歸方程為y=3709.9x-25.493，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。鏈霉素效價(jià)在200～1 000 U·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的替代氮源

由于黃豆粉中含有大量菌體生長(zhǎng)所需蛋白質(zhì)和氨基酸以及一定量的油脂和淀粉，因此在用可溶性氮源替代時(shí)，需要添加適量的碳源。按表1設(shè)計(jì)4組替代氮源F2～F5，F(xiàn)1為對(duì)照。將灰色鏈霉菌孢子接種至種子瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后，將種子液分別接種于裝有F1～F5氮源發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)，并從第72 h開(kāi)始取樣測(cè)定效價(jià)，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果如圖2所示。

表1 F1～F5氮源配比/(g·L-1)

圖2 灰色鏈霉菌在不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵不同時(shí)間的效價(jià)

從圖2可知，4種替代氮源中，只有在以F5為替代氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵水平與對(duì)照(F1)相當(dāng)，且發(fā)酵144 h時(shí)的效價(jià)達(dá)到9 104 U·mL-1，超過(guò)了對(duì)照組；雖然在以F4為替代氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始發(fā)酵水平最高，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵水平升幅明顯變緩。表明，大豆蛋白胨中氮源供給較為充足，完全可以滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)需要；當(dāng)大豆蛋白胨中加入黃豆粉濾液后，由于氮源過(guò)于豐富，可能導(dǎo)致菌體初期生長(zhǎng)過(guò)快而快速衰退，引起后期產(chǎn)物合成不足。另外，補(bǔ)充適宜的碳源在發(fā)酵后期有利于鏈霉素合成。因此，選擇F5作為替代氮源。

2.3 FBB發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素

以F5作為發(fā)酵培養(yǎng)基的替代氮源，將培養(yǎng)好的種子液接種至發(fā)酵罐中，通氣比控制在0.5～1 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌體量迅速增加(圖3a)；連接纖維床反應(yīng)器后，發(fā)酵液被蠕動(dòng)泵泵入纖維床反應(yīng)器中，菌體被纖維床反應(yīng)器吸附；隨著吸附的進(jìn)行，菌體和產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物也在纖維床反應(yīng)器上進(jìn)行交換，新生的富有活力的菌體被吸附上去，而衰老的自溶的菌體脫落下來(lái)，同時(shí)代謝產(chǎn)物隨著清液回流至發(fā)酵罐內(nèi)；大約循環(huán)吸附2 h后，菌體幾乎全部吸附至纖維床反應(yīng)器上(圖3c)，發(fā)酵液同時(shí)變得澄清(圖3b)。

圖3 連接纖維床反應(yīng)器前后發(fā)酵液和菌體照片

2.4 FBB發(fā)酵與傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素的比較

以F5作為發(fā)酵培養(yǎng)基的替代氮源，分別利用FBB和傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素，比較鏈霉素效價(jià)和還原糖含量，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可知，F(xiàn)BB的初始發(fā)酵水平與傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵的基本持平；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵水平逐漸上升，在96 h時(shí)FBB發(fā)酵水平達(dá)到頂峰，為5 567 U·mL-1；但隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，F(xiàn)BB發(fā)酵水平急劇下降，而傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵水平仍保持一定上升趨勢(shì)，144 h時(shí)達(dá)到8 180 U·mL-1；FBB發(fā)酵的還原糖含量在96 h后基本穩(wěn)定在3.0 g·(100 mL)-1左右，而攪拌發(fā)酵的還原糖含量持續(xù)下降。推測(cè)還原糖利用度對(duì)后期鏈霉素合成影響顯著，F(xiàn)BB發(fā)酵的還原糖含量在96 h后基本穩(wěn)定，因此導(dǎo)致發(fā)酵水平急劇下降。雖然從長(zhǎng)周期發(fā)酵結(jié)果看，F(xiàn)BB發(fā)酵相對(duì)于傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵還有一定差距，但在短周期范圍內(nèi)，與傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵水平基本相當(dāng)。另外，F(xiàn)BB發(fā)酵的菌體幾乎全部吸附在纖維床反應(yīng)器上，而發(fā)酵液保持澄清，為后期提取純化提供了便利。因此，F(xiàn)BB發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素較傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵更具優(yōu)勢(shì)。

圖4 FBB發(fā)酵與傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素的比較

2.5 討論

目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗生素受到很多因素的制約，比如廢水排放、廢棄菌體處理等。傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵采用的是分批發(fā)酵，產(chǎn)生的菌體量巨大；提取發(fā)酵液時(shí)要用過(guò)濾設(shè)備將菌體與清液分離；天然有機(jī)原料的使用帶來(lái)的發(fā)酵液黏度高、難過(guò)濾、能耗高等問(wèn)題；過(guò)濾后大量濕菌體為有害物，不能隨意傾倒，需通過(guò)干燥、焚燒等方法進(jìn)行處理，消耗大量的動(dòng)力、蒸汽等。本研究采用FBB發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素，將灰色鏈霉菌吸附在纖維床反應(yīng)器上，使其在固定化條件下生產(chǎn)鏈霉素，同時(shí)達(dá)到菌體和發(fā)酵液分離的效果。

黃豆粉是一種常用的價(jià)格低廉的優(yōu)質(zhì)氮源，但由于其固體不溶性物質(zhì)含量高，容易造成培養(yǎng)基黏稠、泡沫多，從而加大過(guò)濾難度。為了增強(qiáng)菌體在纖維床反應(yīng)器上的吸附，本研究對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，采用可溶性有機(jī)氮源大豆蛋白胨替代黃豆粉，并添加一定量蔗糖促進(jìn)鏈霉素的合成。在大豆蛋白胨為18 g·L-1、蔗糖為20 g·L-1時(shí)可完全替代黃豆粉，為菌體生長(zhǎng)提供足量易吸收的優(yōu)質(zhì)氮源，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和鏈霉素合成，搖瓶培養(yǎng)144 h的發(fā)酵水平達(dá)到9 104 U·mL-1，同時(shí)發(fā)酵液的黏度也大大降低。

利用FBB可以將菌體固定化，用于生產(chǎn)有機(jī)酸或酶，該方法在工業(yè)上已有規(guī)?；瘧?yīng)用[8-11]，但應(yīng)用于好氧菌的報(bào)道相對(duì)較少。本研究首次將FBB應(yīng)用于鏈霉素發(fā)酵生產(chǎn)，將鏈霉素產(chǎn)生菌固定在棉質(zhì)纖維上，發(fā)酵96 h時(shí)鏈霉素效價(jià)達(dá)到5 567 U·mL-1。由于菌體全部被固定，發(fā)酵液保持澄清，這不僅有利于從無(wú)菌體的發(fā)酵液中進(jìn)行產(chǎn)物的提取和純化，也可以重復(fù)利用菌體生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而縮短發(fā)酵周期，進(jìn)一步提高鏈霉素在發(fā)酵過(guò)程中的體積生產(chǎn)率。

3 結(jié)論

采用可溶性有機(jī)氮源大豆蛋白胨替代黃豆粉，并添加一定量蔗糖促進(jìn)鏈霉素的合成。在大豆蛋白胨為18 g·L-1、蔗糖為20 g·L-1時(shí)可完全替代黃豆粉，為菌體生長(zhǎng)提供足量易吸收的優(yōu)質(zhì)氮源，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和鏈霉素合成，在1 L FBB中發(fā)酵96 h時(shí)鏈霉素效價(jià)達(dá)到5 567 U·mL-1。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，所有菌絲都附著在一起，而發(fā)酵液保持澄清。本研究初步探討了FBB發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素的可能性，如果未來(lái)能在FBB結(jié)構(gòu)改進(jìn)、工藝參數(shù)優(yōu)化控制上取得突破，使其可以真正在發(fā)酵水平上趕超傳統(tǒng)攪拌發(fā)酵，做到菌體重復(fù)利用，那么這種新型的FBB將會(huì)解決目前困擾發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的很多問(wèn)題，真正做到綠色、環(huán)保、高效和低能耗。

(感謝河北省人社廳提供在俄亥俄州立大學(xué)訪(fǎng)學(xué)研究期間的資金支持！感謝華北制藥華勝有限公司提供在俄亥俄州立大學(xué)訪(fǎng)學(xué)研究期間的資金支持！感謝俄亥俄州立大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系楊尚天教授及其實(shí)驗(yàn)室成員對(duì)本研究的幫助！)