王永霞，王嬌嬌，黃燕妮，林英姿

單純皰疹病毒 (herpes simplex virus, HSV)屬于皰疹病毒科a亞科，在人群中感染極為普遍，潛伏和復(fù)發(fā)感染者可達(dá)90%[1]，可通過(guò)皮膚、黏膜直接接觸感染機(jī)體，引起的皰疹性角膜炎致盲率較高，未經(jīng)治療的病毒性腦炎病死率可達(dá)80%，存活者亦可因中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷留有智力、語(yǔ)言、行動(dòng)障礙等不同程度后遺癥[2-4]。課題組前期從海南紅樹(shù)林中分離獲得一株淡紫擬青霉，體外研究發(fā)現(xiàn)其分泌的胞外多糖具有一定的抗HSV-1作用，可抑制病毒吸附和生物合成[5]，但體內(nèi)抗病毒效果未知。本研究擬腹腔注射HSV-1建立小鼠感染模型，觀察淡紫擬青霉胞外多糖體內(nèi)抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑、儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7周齡SPF級(jí)健康昆明種雄性小鼠75只，體重18～22 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：淡紫擬青霉胞外多糖由本實(shí)驗(yàn)室制備；非洲綠猴腎細(xì)胞(vero cell line, Vero細(xì)胞)購(gòu)于中科院干細(xì)胞庫(kù)(SCSP-520、CCL-81TM)。HSV-1病毒液由本實(shí)驗(yàn)室保存。小鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 試劑盒均購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒升級(jí)版(離心柱型)購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，HSV-1陽(yáng)性模板購(gòu)于武漢百泰基因工程有限公司(注冊(cè)號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20173400732)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：生物安全柜(SG403A-HE)購(gòu)于Baker公司，CO2培養(yǎng)箱[(MCO-18AC)松下電器有限公司]，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-950E)和高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司)，AE2000倒置生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，PCR儀(Biometra GmbH公司)，酶標(biāo)分析儀[(DNM-9606),北京普朗新技術(shù)有限公司]，全自動(dòng)凝膠成像分析儀[(JY04S-3E)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)]。

1.2方法

1.2.1病毒滴定：HSV-1于Vero細(xì)胞中傳代2次后接種于已長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞中，觀察48～72 h內(nèi)的細(xì)胞病變情況(cytopathic effect， CPE)，當(dāng)CPE達(dá)“+++～++++”時(shí)收獲病毒，按Reed -Muench法滴定其半數(shù)組織感染量(50 % tissue culture infective dose, TCID50)為10-4，擬用100TCID50濃度病毒感染小鼠。

1.2.2小鼠HSV-1感染模型建立：7周齡昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，病毒對(duì)照組，低、中、高劑量組，每組15只。低、中、高劑量組和病毒對(duì)照組小鼠分別給予HSV-1 0.5 ml腹腔注射，正常對(duì)照組小鼠給予DMEM 0.5 ml腹腔注射。次日低、中、高劑量組小鼠分別經(jīng)腹腔注射淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)；正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.5 ml，連續(xù)注射7 d。每日觀察并記錄小鼠的進(jìn)食情況、有無(wú)倦怠、豎毛、蜷縮及死亡等。淡紫擬青霉胞外多糖干預(yù)結(jié)束后第3天，各組小鼠眼球取血，分離血清置于-20℃?zhèn)溆?。處死小鼠，無(wú)菌條件下取肝臟，部分置于10%多聚甲醛中固定，常規(guī)制作石蠟切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察肝臟病理變化。

1.2.3腦組織勻漿致Vero細(xì)胞病變作用：取各組小鼠同一部位腦組織20 mg，預(yù)冷PBS沖洗后，再于各管中加PBS 0.3 ml，組織研磨器研磨成勻漿，超聲破碎儀破細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，取該上清液100 μl與2 ml含5%胎牛血清的DMEM混勻后，接種于已長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞中，觀察7 d內(nèi)細(xì)胞病變情況。

1.2.4腦組織病毒載量檢測(cè)：另取各組小鼠同一部位的腦組織20 mg，加預(yù)冷PBS液0.5 ml，組織研磨器研磨成勻漿，12 000 r/min離心15 min。沉淀用HSV-1核酸檢測(cè)試劑盒提取病毒基因組DNA。HSV-1UL36基因引物據(jù)根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，序列如下，UL36F：5'-TAC GTC CTC ACC GTC ATC AAC-3'，UL36R：5'-CGC CAA AAG GTG TAA ATG TG -3'；反應(yīng)體系為：Taq PCR MasterMix 11.25 μl，病毒基因組DNA或陽(yáng)性對(duì)照模板DNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 6.75 μl，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 60 s，53℃ 40 s，72℃ 40 s，72℃ 7 min，共30個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物6 μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。通過(guò)Gel-Pro Analyzer圖像分析軟件分析產(chǎn)物電泳條帶的光密度掃描值，將實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性模板UL36條帶光密度掃描值的比值作為UL36基因相對(duì)含量。

1.2.5血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α分泌情況：采用ELISA法，試劑盒用前平衡至室溫，檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各樣品OD值計(jì)算其細(xì)胞因子含量。

2 結(jié)果

2.1生存情況 除正常對(duì)照組外，其余4組小鼠接種HSV-1后次日出現(xiàn)食欲減退、豎毛、倦怠、蜷縮等癥狀，3～4 d達(dá)高峰。各組間小鼠死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。各組未死亡小鼠于1周后癥狀開(kāi)始緩解，胞外多糖干預(yù)組小鼠2周內(nèi)完全緩解，而病毒對(duì)照組小鼠癥狀緩解較為緩慢，延遲至第3周。

表1 5組小鼠死亡情況比較

2.2肝臟病理變化 正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；病毒對(duì)照組小鼠部分肝細(xì)胞腫脹，匯管區(qū)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)有少量炎性細(xì)胞；低劑量組亦見(jiàn)肝組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)肝細(xì)胞腫脹；中劑量組肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；高劑量組肝實(shí)質(zhì)內(nèi)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。見(jiàn)圖1。

圖1 5組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)病理改變(HE×200)低、中、高劑量組小鼠分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)

2.3腦組織勻漿上清液致Vero細(xì)胞病變比較 HSV-1接種次日，病毒對(duì)照組和低劑量組少數(shù)細(xì)胞脫落、融合；正常對(duì)照組和中、高劑量組細(xì)胞病變不明顯。接種第3天病毒對(duì)照組和低劑量組細(xì)胞脫落明顯增多，融合細(xì)胞亦增多；中劑量和高劑量組少量細(xì)胞開(kāi)始脫落、融合，但所致細(xì)胞病變作用明顯弱于病毒對(duì)照組和低劑量組，正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變。各組細(xì)胞病變于接種4～5 d達(dá)高峰。見(jiàn)圖2。

圖2 5組小鼠腦組織勻漿上清液Vero細(xì)胞形態(tài)(×100)低、中、高劑量組小鼠分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d)；Vero為非洲綠猴腎細(xì)胞

2.4腦組織HSV-1病毒載量比較 病毒對(duì)照組HSV-1病毒DNA相對(duì)含量為0.505±0.025，低、中、高劑量組分別為0.496±0.055、0.248±0.034、0.262±0.033。與病毒對(duì)照組相比，中、高劑量組HSV-1病毒DNA相對(duì)含量明顯減低(P<0.01)，但低劑量組與病毒對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 5組小鼠腦組織HSV-1病毒載量比較1. Marker；2.正常對(duì)照組；3.低劑量組；4.中劑量組；5.病毒對(duì)照組；6高劑量組；7.陽(yáng)性模板；低、中、高劑量組分別給予淡紫擬青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d);HSV-1為單純皰疹病毒-1

2.5血清IFN-γ、IL-12、TNF-α含量比較 與正常對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組和低、中、高劑量組血清IFN-γ、IL-12、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。高劑量組IFN-γ高于病毒對(duì)照組和低、中劑量組(P<0.01)，但病毒對(duì)照組和低、中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中、高劑量組IL-12顯著高于病毒對(duì)照組和低劑量組(P<0.01)，但病毒對(duì)照組和低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與病毒對(duì)照組比較，低、中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，且高劑量組和中劑量組均低于低劑量組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 5組小鼠血清IFN -γ、IL-12和TNF-α水平比較

3 討論

多糖類化合物作為重要的生物活性物質(zhì)，廣泛參與了生物體內(nèi)細(xì)胞識(shí)別和功能調(diào)控，作用涉及細(xì)胞生命的全部時(shí)間和空間，多糖已被證實(shí)參與了病原體感染，糖鏈決定著細(xì)胞識(shí)別、聚集和受體作用，寄生物或病毒表面的寡糖能與宿主細(xì)胞表面的受體作用，產(chǎn)生感染。研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖能活化巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)IFN-γ、IL-12和TNF-α等細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[7-9]。海洋生物由于獨(dú)特的生活環(huán)境導(dǎo)致其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)有別于陸生生物。本研究結(jié)果顯示，腹腔接種HSV-1后次日大部分小鼠出現(xiàn)食欲減退、豎毛、倦怠、蜷縮等癥狀，3～4 d達(dá)高峰，淡紫擬青霉胞外多糖干預(yù)組小鼠癥狀緩解較病毒對(duì)照組提前，但各組間死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組部分肝細(xì)胞腫脹，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組亦見(jiàn)肝組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；高劑量組肝實(shí)質(zhì)內(nèi)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉病變不明顯。說(shuō)明淡紫擬青霉胞外多糖可緩解HSV-1感染所致的肝臟病理改變且該作用呈劑量依賴性。

將各組小鼠腦組織勻漿上清液接種于Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)中劑量和高劑量組較病毒對(duì)照組和低劑量組致細(xì)胞病變作用明顯減輕，說(shuō)明淡紫擬青霉胞外多糖可能抑制了HSV-1在腦組織中的復(fù)制。本研究檢測(cè)了各組小鼠同一部位腦組織的HSV-1病毒DNA相對(duì)含量，結(jié)果顯示中、高劑量組HSV-1相對(duì)含量顯著低于病毒對(duì)照組，低劑量組HSV-1病毒DNA相對(duì)含量與病毒對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示中劑量和高劑量淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)HSV-1病毒的抑制作用較好，而低劑量對(duì)HSV-1病毒無(wú)明顯抑制作用；說(shuō)明淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)HSV-1病毒的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

IFN-γ作為重要的Th1型細(xì)胞因子可刺激病毒感染細(xì)胞表達(dá)MHC-1類分子、激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，參與抗病毒免疫；另外IFN-γ還可干擾病毒復(fù)制、抑制B細(xì)胞的功能[10-11]。IL-12作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可刺激IFN -γ分泌，誘導(dǎo)Th1型抗病毒免疫反應(yīng)[12-13]。TNF-α在HSV-1感染中具有一定的抗病毒作用，同時(shí)也參與了繼發(fā)性免疫損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示，病毒對(duì)照組小鼠血清IFN-γ、IL-12和TNF-α水平均顯著高于正常對(duì)照組。高劑量組IFN-γ高于病毒對(duì)照組和低、中劑量組；中、高劑量組IL-12顯著高于病毒對(duì)照組和低劑量組。與病毒對(duì)照組比較，低、中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組。說(shuō)明不同劑量淡紫擬青霉胞外多糖均不能對(duì)TNF-α分泌完全抑制，TNF-α的持續(xù)增高提示預(yù)后不良。

綜上所述，紅樹(shù)林淡紫擬青霉胞外多糖可能通過(guò)刺激IFN-γ和IL-12、抑制TNF-α分泌達(dá)到抗病毒的目的，也可能通過(guò)早期干預(yù)病毒復(fù)制，減少病毒載量，間接影響了細(xì)胞因子分泌，從而減輕了HSV-1感染后的免疫病理?yè)p傷。然而淡紫擬青霉胞外多糖的作用機(jī)制如何，作用靶點(diǎn)在哪，仍需進(jìn)一步研究。