李長(zhǎng)宇，宋少軍，黃桂芳，祝 福，曹亞雷，金茂林，冉浩男

腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展速度較快，可侵犯正常腦組織，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)導(dǎo)致顱內(nèi)壓逐漸升高，引起患者四肢乏力、惡心、頭暈、癲癇發(fā)作等癥狀[1-2]。如何減輕腦膠質(zhì)瘤引起的顱腦損傷癥狀、恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞功能已經(jīng)引起越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注。冬凌草甲素是冬凌草的活性成分，具有減小腦梗死體積、抗氧化、抗炎、擴(kuò)張血管、抗疲勞、抑制血小板聚集等藥理作用[3-4]。本研究以人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株為模型，探討了冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞放射治療(放療)敏感性的影響，以期為腦膠質(zhì)瘤治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 冬凌草甲素(Sigma公司，DMSO溶解后配置成相應(yīng)濃度備用)，人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)，DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，V-FITC和PI染色試劑盒(美國(guó)BD公司)，ECL化學(xué)發(fā)光液(北京Solarbio公司)，Hoechst 33258熒光染色試劑盒、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9抗體(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)：將人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，鏈霉素100 mg/L，青霉素1×105U/L)中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，3 d換液一次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組：對(duì)照組為細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)其他干預(yù)。冬凌草甲素組在培養(yǎng)基中加入溶于DMSO的冬凌草甲素(10 μmol/L)，培養(yǎng)24 h。X線照射組：使用21EX型雙光子高能直線加速器，劑量率為4 Gy/min，總劑量為6 Gy，照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。聯(lián)合放療(X線照射+冬凌草甲素)組：冬凌草甲素干預(yù)24 h后，給予X線照射。

1.2.3人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖抑制率：先配置MTT溶液(用PBS配置，將pH酸堿度調(diào)制7.4，配置MTT液濃度為5 mg/ml)，上述各組U251細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為1×105/ml，棄去原有培養(yǎng)液，加入配置好的MTT液培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加150 μl DMSO液，搖床振蕩5 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上用570 nm吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡熒光染色：采用Hoechst 33258熒光染色，人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS液洗滌細(xì)胞2次，在150 μl 的Binding Buffer中加入2 μl Hoechst染液(10 μg/ml)避光反應(yīng)15 min，棄去上清液，PBS液洗3遍，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集各組細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/ml，磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞后，分別加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕柔振蕩混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡水平。

1.2.6Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表達(dá)水平：采用Western Blot檢測(cè)，提取蛋白質(zhì)后，以Brandford法測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。每孔加入40 μg蛋白樣品，然后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓200 V，電泳40 min后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過(guò)夜，洗膜后室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白光密度對(duì)比內(nèi)參條帶光密度，比較不同樣本的相對(duì)表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1冬凌草甲素對(duì)放療后人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響 4組細(xì)胞的增殖率分別為：對(duì)照組(101.38±4.07)%、冬凌草甲素組(65.47±5.97)%、X線照射組(68.79±3.05)%、聯(lián)合放療組(44.43±5.27)%。與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯(lián)合放療組細(xì)胞增殖率降低，且聯(lián)合放療組低于冬凌草甲素組和X線照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)比較 正常細(xì)胞的細(xì)胞核在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為彌散淺藍(lán)色弱熒光；凋亡的細(xì)胞核表現(xiàn)為致密的亮藍(lán)色強(qiáng)熒光。4組細(xì)胞凋亡率分別為：對(duì)照組(4.66±2.73)%、冬凌草甲素組(25.03±7.56)%、X線照射組(24.83±6.07)%，聯(lián)合放療組(44.43±5.27)%。與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯(lián)合放療組凋亡細(xì)胞率增高，且聯(lián)合放療組高于冬凌草甲素組和X線照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見(jiàn)圖1。

圖1 4組人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡情況(Hoechst×200)

2.3流式細(xì)胞計(jì)數(shù)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡率比較 4組細(xì)胞凋亡率分別為對(duì)照組(4.13±3.52)%、冬凌草甲素組(31.03±4.71)%、X線照射組(22.58±5.73)%，聯(lián)合放療組(43.61±5.10)%。與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組、聯(lián)合放療組細(xì)胞凋亡率增高，且聯(lián)合放療組高于冬凌草甲素組和X射線照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)4組人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡率比較

2.4冬凌草甲素對(duì)放療后人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，冬凌草甲素組及X線照射組、聯(lián)合放療組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平均升高，且聯(lián)合放療組高于冬凌草甲素組和X線照射組(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖3。

表1 4組Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

圖3 冬凌草甲素對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)水平的影響

3 討論

腦膠質(zhì)瘤患者臨床表現(xiàn)多樣，同樣大小的腦膠質(zhì)瘤在不同患者身上表現(xiàn)的癥狀也不相同，可長(zhǎng)期無(wú)任何癥狀或僅出現(xiàn)輕微癥狀。上述表現(xiàn)與腫瘤本身的占位效應(yīng)、日益增高的顱內(nèi)壓及腫瘤周圍區(qū)域的腫脹有關(guān)。腦膠質(zhì)瘤在神經(jīng)系統(tǒng)以外的轉(zhuǎn)移非常罕見(jiàn)，部分手術(shù)患者僅表現(xiàn)為局部復(fù)發(fā)，或者擴(kuò)展到顱內(nèi)的其他部位[5-6]。高級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤很難通過(guò)手術(shù)完全切除，因此，有效的放化療對(duì)提高該類患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期至關(guān)重要。

腦膠質(zhì)瘤綜合治療包括手術(shù)、化療和放療。放療是通過(guò)各種不同能量射線給予腫瘤組織均勻準(zhǔn)確的照射，以抑制和殺滅癌細(xì)胞[7]，可單獨(dú)使用，也可與手術(shù)、化療等配合。由于腫瘤組織中乏氧細(xì)胞的存在，對(duì)放射線的耐受比氧細(xì)胞至少高3倍，常規(guī)放療不能殺死乏氧細(xì)胞，限制了放療的效果，這也是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[8-10]。

文獻(xiàn)報(bào)道，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，針對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞，其抑制途徑各不相同[11-12]。X線照射細(xì)胞后，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)一系列改變，包括分子、代謝水平、骨架結(jié)構(gòu)和功能等，以應(yīng)對(duì)X線的損傷[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組、X線照射組及聯(lián)合放療組人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖率降低，且聯(lián)合放療組低于冬凌草甲素組及X線照射組。與對(duì)照組比較，冬凌草甲素組、X線照射組及聯(lián)合放療組人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡率增高，且聯(lián)合放療組高于冬凌草甲素組及X線照射組。說(shuō)明單用冬凌草甲素或放療對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的直接抑制作用有限，但二者聯(lián)合應(yīng)用，能夠增加U251細(xì)胞放療敏感性，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖率明顯下降及凋亡率增加。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞炎癥、應(yīng)激和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[15-18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冬凌草甲素組和X線照射組均能上調(diào)U251細(xì)胞內(nèi)的Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)，且聯(lián)合放療組高于冬凌草甲素組及X線照射組。說(shuō)明Caspase-3及Caspase-9共同參與了冬凌草甲素促進(jìn)U251細(xì)胞放療敏感性的調(diào)節(jié)過(guò)程。

綜上所述，利用藥物增加生物體的放療敏感性，對(duì)腦膠質(zhì)瘤的臨床治療有重要意義；冬凌草甲素可顯著提高腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的放療敏感性，在腦膠質(zhì)瘤的治療方面具有重要價(jià)值。