范曉月，郭 明,2，顧 奕，何云核，趙富榮

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 理學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

喜樹Camptotheca acuminata為珙桐科Nyssaceae 喜樹屬Camptothec多年生亞熱帶落葉闊葉樹，是我國特有樹種[1-2]，其有效成分喜樹堿屬于生物堿類物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛和消炎等功效[3]。喜樹堿除了具有生物堿的特點(diǎn)外，還具有特異性作用的特點(diǎn)，其作用于DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I，形成穩(wěn)定的“藥物-Topo I-DNA”三元復(fù)合物[4]，干擾DNA 的復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鹽酸依立替康（Irinotecan Hydrochloride，CPT-11，C33H38N4O6）是以喜樹堿為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，在喜樹堿7 位上取代得到的產(chǎn)物，10-羥基喜樹堿（HCPT，C20H16N2O5）是天然的喜樹堿衍生物之一，兩者具有喜樹堿的抗癌特性，且涵蓋了喜樹堿的主要活性，因此，CPT，HCPT 和CPT-11 可以作為喜樹堿類生物堿研究的模型化合物。此外，由于肝癌是我國常見的惡性腫瘤病之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[5-7]，肝癌的病死率僅次于胃癌和肺癌，嚴(yán)重威脅著人類的健康[8-9]，而目前的諸多研究文獻(xiàn)中，多是對肺癌、宮頸癌、咽鱗癌[10-16]等腫瘤細(xì)胞研究為主，因此，探索CPT/HCPT/CPT-11 對肝癌細(xì)胞的影響作用很有必要。目前，關(guān)于喜樹堿類物質(zhì)抗癌機(jī)理的研究主要集中于腫瘤細(xì)胞的凋亡[17]、自噬[18]、遷移[19]以及細(xì)胞周期[20]等方面，而關(guān)于SMMC-7721 肝癌細(xì)胞的氧化損傷作用的研究報(bào)道較少。然而，抗氧化損傷作用是需氧生物特別是人類細(xì)胞具有的一整套抗氧化防御機(jī)制，包括過氧化氫酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）等[21]的參與，對細(xì)胞這一特性開展研究可為腫瘤細(xì)胞的治療提供思路。

本實(shí)驗(yàn)選擇CPT，HCPT 和CPT-11（結(jié)構(gòu)式如圖1），采用CCK-8 法、熒光顯微鏡觀察法、熒光定量PCR（RT-PCR）法、蛋白免疫印跡法（Western blot）和細(xì)胞活性氧（ROS）檢測法開展了相關(guān)研究。在研究CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞增殖抑制和凋亡的基礎(chǔ)上，探討了CPT，HCPT 和CPT-11 對肝癌SMMC-7721 細(xì)胞的抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響情況，并試圖通過研究CPT，HCPT 和CPT-11 對肝癌細(xì)胞的抗氧化損傷作用的影響情況，補(bǔ)充喜樹堿的抗癌機(jī)理，并為抗癌研究提供參考信息。

圖1 喜樹堿及其衍生物的結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of CPT and its derivatives

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物細(xì)胞

肝癌細(xì)胞系SMMC-7721（北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫）。

1.1.2 試劑與儀器

喜樹堿（Camptothecin，CPT，純度99%）、10-羥基喜樹堿（10-Hydroxycamptothecin，HCPT，純度98%）、鹽酸依立替康（Topotecan Hydrochloride Salt，CPT-11，純度99%）（薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司）；改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（FBS，HyClone）；青霉素鏈霉素溶液/雙抗（HyClone，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）；杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS，pH7.4，上海易利生物技術(shù)有限公司）；CCK-8 試劑盒（上海七海復(fù)泰生物技術(shù)有限公司）；AxyPrep 總RNA 小量制備試劑盒（美國Axygen 公司）；TB GreenTM Premix Ex Taq? II（TliRNaseH Plus）熒光定量試劑盒（日本Takara公司）；TureColor 雙色預(yù)染蛋白Maker（上海生工生物股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒（杭州寶科生物科技有限公司）；Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody HRP conjugated、CAT單克隆抗體（CATAntibody）、SOD1單克隆抗體（SOD1Antibody）（上海超研生物科技有限公司）；ClarityTM Western ECL Substrate（美國Bio-Rad 公司）等。

Thermo Scientific 生物安全柜和Thermo DH-800 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；CKX31 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；3K15 離心機(jī)（德國Sigma 公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）；恒溫?fù)u床（上海一恒科技有限公司）；恒溫金屬浴儀（美國Major Science 公司）；T100PCR 儀、CFX Connect 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、TS.B-108 往復(fù)式脫色搖床（北京佳源興業(yè)科技有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與溶液配置 完全培養(yǎng)液的配置：于滅菌的100 mL 血清瓶中加入10 mL 胎牛血清、1 mL 的100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素，再加入RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液定容至100 mL，即為細(xì)胞完全培養(yǎng)液。將肝癌細(xì)胞系SMMC-7721 接種于完全培養(yǎng)基，置于37 °C、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理組用DMSO 配制CPT/HCPT/CPT-11 母液，用0.22 μm 細(xì)菌過濾器過濾，配制藥物濃度分別為5 μg·mL-1，10 μg·mL-1，20 μg·mL-1，40 μg·mL-1，80 μg·mL-1，置于4℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 消化SMMC-7721 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)·mL-1，以每孔100 μL 接種于96孔板中，待接種24 h 貼壁生長后，棄舊培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的HCPT，CPT-11 和CPT 溶液100 μL 于實(shí)驗(yàn)組中，共計(jì)15 種處理，即5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和80 μg·mL-1的HCPT，CPT 和CPT-11。對照組加等體積1.2.1 中配好的細(xì)胞完全培養(yǎng)液，每種處理設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。于兩塊96 孔板作用24 h 和48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37°C 孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 處的吸光值。細(xì)胞生長抑制率（IR）計(jì)算公式如公式（1），再將所得計(jì)算結(jié)果進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

式中，A實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)處理組在450 nm 處的平均吸光值，A空白為空白組在450 nm 處的平均吸光值，A對照為對照組在450 nm 處的平均吸光值。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)·mL-1接種于6 孔板中，正常培養(yǎng)24 h 后吸去6 孔板里的培養(yǎng)液，加入2 mL 已經(jīng)配好的不同質(zhì)量濃度的CPT/HCPT/CPT-11 溶液，作用24 h 后觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.2.4 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 將不同質(zhì)量濃度（10 μg·mL-1，40 μg·mL-1，80 μg·mL-1）的CPT，HCPT 和CPT-11 處理SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，消化并收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察CPT/HCPT/CPT-11 誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.5 RT-PCR 檢測CAT和SOD1mRNA 的轉(zhuǎn)錄情況 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)操作，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)·mL-1，將混合均勻的細(xì)胞懸液接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。CPT，HCPT和CPT-11（10 μg·mL-1，40 μg·mL-1，80 μg·mL-1）溶液處理SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，消化離心，收集各組細(xì)胞，用AxyPrep 總RNA 小量制備試劑盒提取細(xì)胞RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用核酸分析儀檢測樣品的濃度和純度，將檢測合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with Gdan Eraser （Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。c DNA 的合成參照逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后通過凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參基因，CAT和SOD1基因的表達(dá)水平按公式（2）計(jì)算，RT-PCR 引物設(shè)計(jì)見表1。

式中，A為對照組（目的基因）的Ct值，B為對照組（內(nèi)參基因）的Ct值，E為實(shí)驗(yàn)組（目的基因）的Ct值，F(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組（內(nèi)參基因）的Ct值。Ct為每個(gè)PCR 反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測CAT和SOD1蛋白表達(dá)情況 同1.2.5 節(jié)的方法處理SMMC-7721 細(xì)胞，CPT，HCPT 和CPT-11（10 μg·mL-1，40 μg·mL-1，80 μg·mL-1）溶液作用細(xì)胞24 h 后，消化離心，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 清洗2 遍。加入適量細(xì)胞裂解液置于冰上孵育30 min，在4 °C 以2 500 r·min-1離心15 min。取上清，即為細(xì)胞全蛋白質(zhì)。蛋白濃度檢測根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)樣品取蛋白質(zhì)20 μg，加入5×Loading buffer 調(diào)整上樣緩沖液濃度為1×Loading buffer，99 °C 加熱10 min 后用15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶在常溫下封閉1 h，依次滴加一抗（兔抗，工作濃度均為1∶1 000，4 °C 過夜）及二抗（1∶10 000 HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫1 h），設(shè)GAPDH為內(nèi)參基因，用TBST （10 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，0.1% Tween-20，pH7.6）充分洗滌后，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行觀察。

2008年全球金融危機(jī)爆發(fā)，導(dǎo)致全球經(jīng)濟(jì)衰退，全球貿(mào)易環(huán)境急劇惡化，貿(mào)易保護(hù)主義勢頭明顯回升，加上人民幣匯率浮動、勞動力成本和原材料價(jià)格等各種因素，國內(nèi)外貿(mào)企業(yè)在殘酷的現(xiàn)實(shí)面前逐漸認(rèn)識到自身轉(zhuǎn)型升級的必要性。

表1 基因引物序列和片段長度Table 1 Gene primer sequence and fragment length

1.2.7 檢測ROS 的變化 經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞以5×105個(gè)·孔-1的密度接種在6 孔板中，培養(yǎng)過夜。用CPT，HCPT 和CPT-11 溶液（10 μg·mL-1，40 μg·mL-1，80 μg·mL-1）處理24 h。通過使用ROS 試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，以獲取處理后SMMC-7721 細(xì)胞中ROS 的變化。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±sd）表示，并經(jīng)GraphPad 統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差檢驗(yàn)（one-way，ANOVA），P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8 法檢測喜樹堿類物質(zhì)對SMMC-7721 細(xì)胞增殖能力的影響

由表2 表明，40 μg·mL-1和80 μg·mL-1濃度處理SMMC-7721 細(xì)胞24 h 和48 h 后，SMMC-7721 細(xì)胞的相對活性顯著下降，且隨著藥物濃度的增加，CPT-11 和HCPT對SMMC-7721 細(xì)胞的抑制率顯著提高（P<0.05）。因此，喜樹堿類生物堿對SMMC-7721 細(xì)胞的增殖具有抑制作用并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)性，且CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞增殖的抑制作用大小為HCPT> CPT-11>CPT。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

根據(jù)CCK-8 檢測結(jié)果，選擇10 μg·mL-1，40 μg·mL-1和80 μg·mL-1的CPT，HCPT 和CPT-11 處理SMMC-7721細(xì)胞株24 h，并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，如圖2。由圖2 可知，與對照組相比，CPT，HCPT 和CPT-11 作用24 h 后，SMMC-7721 細(xì)胞密度降低、形態(tài)固縮，貼壁松散，出現(xiàn)游離，失去了正常生長狀態(tài)下扁長透亮的形態(tài)，細(xì)胞碎片數(shù)也顯著增加，且隨著藥物濃度的增加，這些現(xiàn)象具有劑量依賴性。

表2 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞生長的抑制作Table 2 Inhibition of SMMC-7721 cell by CPT/HCPT/CPT-11

圖2 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 2 Effect of CPT/HCPT/CPT-11 on morphology of SMMC-7721 cells

2.3 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響

使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞載玻片樣品。在細(xì)胞凋亡的早期階段，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外部的磷脂酰絲氨酸與Annexin V 結(jié)合。碘化丙啶染色對壞死或晚期凋亡細(xì)胞呈陽性，結(jié)果如圖3。由圖3 顯示，暴露在CPT，HCPT和CPT-11中的SMMC-7721細(xì)胞膜表面出現(xiàn)明亮的果綠色，早期凋亡細(xì)胞不會被Propidium Iodide 染色或顯示背景熒光，而壞死或晚期凋亡細(xì)胞則會被染色，表明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已被破壞，細(xì)胞處于凋亡晚期，PI 陽性細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)出不同強(qiáng)度的黃紅色。

2.4 RT-PCR 檢測CAT 和SOD1 mRNA 的表達(dá)情況

以GAPDH為內(nèi)參基因，通過RT-PCR 法分析考察CPT，HCPT和CPT-11作用SMMC-7721細(xì)胞株24 h后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因CAT和SOD1mRNA 表達(dá)水平的影響，RNA 濃度及純度檢測結(jié)果如表3。CPT，HCPT和CPT-11 對細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因CAT和SOD1mRNA 表達(dá)水平的影響見圖4 和表4。

表3 RNA 濃度和純度的提取Table 3 Concentration and purity of extracted RNA

圖3 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of CPT/HCPT/CPT-11 on apoptosis of SMMC-7721 cells

由表3、圖3 和表4 表明，與對照組相比，各樣品處理組SMMC-7721 細(xì)胞的CAT和SOD1的mRNA 表達(dá)水平均降低，在處理濃度最大時(shí)最低，CPT，HCPT 和CPT-11 的CAT表達(dá)分別比對照降低了36%，94.8%和43.7%，SOD1表達(dá)分別比對照降低了43.1%，92.3%和47.9%?？梢娀虮磉_(dá)水平隨藥物濃度增加而顯著降低（P＜0.05），喜樹堿類物質(zhì)可下調(diào)CAT和SOD1mRNA 水平表達(dá)，并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)性。

2.5 Weste rn blot 檢測CAT 和SOD1 蛋白表達(dá)情況

為進(jìn)一步獲得喜樹堿類物質(zhì)誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，以GAPDH為內(nèi)參基因，于藥物處理24 h后，檢測SMMC-7721 細(xì)胞中CAT和SOD1的表達(dá)，結(jié)果見圖5。由圖5 表明，該組蛋白質(zhì)總量相同，目標(biāo)蛋白CAT和SOD1蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，與RT-PCR 檢測結(jié)果一致。因此，CPT，HCPT 和CPT-11 通過影響CAT和SOD1蛋白的表達(dá)來破壞細(xì)胞的正常生理活動；其中，相比于CPT 和CPT-11，HCPT 對CAT和SOD1蛋白表達(dá)具有較強(qiáng)的抑制作用。

表4 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞中CAT和SOD1 基因表達(dá)的影響Table 4 Effect of CPT/HCPT/CPT-11 on the expression of CAT and SOD1 genes in SMMC-7721 cells

圖4 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞中CAT（A）和SOD1（B）基因表達(dá)的影響Figure 4 Effect of CPT/HCPT/CPT-11 on the expression of CAT and SOD1 genes in SMMC-7721

圖5 不同濃度的CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞中CAT 和SOD1 蛋白表達(dá)的抑制Figure 5 Inhibition of CAT and SOD1 protein expression in SMMC-7721 cells by different concentrations of CPT/HCPT/CPT-11

2.6 ROS 檢測結(jié)果

為了進(jìn)一步確定CPT，HCPT 和CPT-11 誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，處理24 h 后，使用ROS檢測試劑盒檢測SMMC-7721 細(xì)胞中ROS 的變化。

腫瘤細(xì)胞處于相對較高的氧化還原狀態(tài)。如表5 所示，隨著CPT，HCPT 和CPT-11 濃度的增加，SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著增加（P<0.05），在80 μg·mL-1處理時(shí)，ROS 含量增加最多，與對照組相比，CPT，HCPT 和CPT-11 處理后細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量分別增加了58.6%，76.4%和95.8%。這表明CPT，HCPT 和CPT-11可通過增強(qiáng)ROS 的產(chǎn)生來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CAT和SOD1蛋白水平的下降也支持了這一結(jié)果。

表5 CPT，HCPT 和CPT-11 對SMMC-7721 細(xì)胞中ROS 含量的影響Table 5 Effect of CPT/HCPT/CPT-11 on ROS content in SMMC-7721 cells

3 結(jié)論與討論

本研究通過構(gòu)建腫瘤細(xì)胞研究的細(xì)胞水平-蛋白水平-基因水平體系系統(tǒng)探討了CAT，CPT-11 和HCPT 對SMMC-7721 細(xì)胞株的增殖抑制作用及對肝癌細(xì)胞抗氧化損傷相關(guān)基因CAT和SOD1表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)了喜樹堿類物質(zhì)具有抗癌作用，這與已有研究結(jié)果是一致的[22-24]，但與已有研究中的藥物作用機(jī)理有所區(qū)別。此外，本研究首次全面比較了CPT，HCPT 和CPT-11 三種喜樹堿類物質(zhì)對SMMC-7721 細(xì)胞的抗氧化損傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種喜樹堿類物質(zhì)均以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且對SMMC-7721 細(xì)胞增殖的抑制作用大小為HCPT>CPT-11>CPT，說明喜樹堿結(jié)構(gòu)修飾后得到的衍生物抗癌效應(yīng)增強(qiáng)。

研究表明，細(xì)胞氧化還原過程的平衡取決于細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)，這是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素，抗氧化劑減少促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抗氧化劑增加則抑制凋亡[25]。CAT和SOD1是細(xì)胞抗氧化相關(guān)蛋白的典型代表，是細(xì)胞存活所必需的，其中，SOD1能夠清除生物體內(nèi)的O2-，使其轉(zhuǎn)化為H2O2和O2；CAT能夠消除過量的H2O2，以防止其對細(xì)胞造成的傷害[26]。此外，氧化應(yīng)激以細(xì)胞內(nèi)ROS 的增加為特征，且ROS 已被證明可觸發(fā)各類細(xì)胞的凋亡[27]。而在本研究中，ROS 水平檢測、RT-PCR 和Western blot 分析表明，CPT，HCPT 和CPT-11 可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，下調(diào)CAT和SOD1的表達(dá)，從而降低SMMC-7721 細(xì)胞的抗氧化功能，使細(xì)胞發(fā)生氧化脅迫，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見，氧化還原失衡是喜樹堿及其衍生物誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。然而，在本實(shí)驗(yàn)中，對于喜樹堿及其衍生物引起SMMC-7721 細(xì)胞抗氧化功能失衡的機(jī)制尚不清楚，對于細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生增加的原兇以及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑還需深入研究。

4 展望

縱觀國內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的研究，雖取得了長足的發(fā)展，但藥物治療后給人體帶來的毒副作用較大，而從植物中提取的化學(xué)物質(zhì)可有望降低這一毒副作用。來源于植物的喜樹堿可開發(fā)出多種喜樹堿衍生物，且保留了喜樹堿的抗腫瘤特性，因而深入研究喜樹堿類物質(zhì)對各類腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)和作用機(jī)理顯得極有意義，在今后抗癌研究中有較大的應(yīng)用價(jià)值。