谷利偉，趙立琴，范博文，劉勇

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

香蘭素是從香莢蘭豆中提取的一種重要的合成香精，在食品加工，煙草制造等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來(lái)，大量文獻(xiàn)表明香蘭素的作用不僅僅局限于食品添加劑領(lǐng)域，其抗炎、抗氧化、抗衰老等作用也正逐一被揭示[1]。在集約化畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)刻，使用價(jià)格低廉、安全、環(huán)保的天然產(chǎn)物提取物作為添加劑已成為養(yǎng)殖戶及消費(fèi)者均認(rèn)可的方式[2]。

人們對(duì)炎癥反應(yīng)并不陌生，機(jī)體遭受到外來(lái)微生物侵襲或自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變時(shí)，炎癥反應(yīng)會(huì)迅速導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放、以及趨化因子等介質(zhì)的產(chǎn)生，以提高抗病能力并對(duì)受損的組織或器官進(jìn)行修復(fù)，是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)自我調(diào)節(jié)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。而過(guò)度的炎癥反應(yīng)卻會(huì)對(duì)機(jī)體造成一系列消極影響，過(guò)度的炎癥反應(yīng)在清除外來(lái)病原侵襲或恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的同時(shí)也會(huì)增加機(jī)體內(nèi)組織或器官內(nèi)細(xì)胞的變性和壞死，影響機(jī)體正常的生理功能[3]。巨噬細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)重要的組成部分在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色。有大量研究表明，巨噬細(xì)胞的活化直接介導(dǎo)了內(nèi)源性的炎癥反應(yīng)，并且由于其活化后釋放的大量炎癥因子以及一系列炎癥介質(zhì)進(jìn)一步放大了炎癥所帶來(lái)的負(fù)面影響，直接導(dǎo)致周圍功能細(xì)胞的氧化、凋亡和壞死[4-5]。如何通過(guò)限制巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化，合理的控制炎癥反應(yīng)所帶來(lái)的不良影響成為天然免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

巨噬細(xì)胞活化及表型轉(zhuǎn)換一直是天然免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。正常的生理狀態(tài)下巨噬細(xì)胞以靜息狀態(tài)存在于全身的結(jié)締組織，對(duì)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)進(jìn)行監(jiān)管。一旦機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變超出了機(jī)體可調(diào)節(jié)的閾值或機(jī)體遭遇到外來(lái)微生物的侵襲時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)第一時(shí)間發(fā)生活化，一方面增強(qiáng)其自身的吞噬能力；另一方面釋放大量的炎癥因子及炎性介質(zhì)來(lái)清除入侵的病原微生物并幫助機(jī)體進(jìn)行穩(wěn)態(tài)重塑[6-7]。在巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中，其功能也會(huì)隨著表型的變化而發(fā)生明顯的改變。CD11B 作為判斷巨噬細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物在巨噬細(xì)胞的研究中被廣泛提及。在活化初期或疾病的急性期，巨噬細(xì)胞以M1 表型存在，高表達(dá)CD68 并發(fā)揮促炎效應(yīng)[8]；而在活化后期或疾病的轉(zhuǎn)歸期，巨噬細(xì)胞以M2 表型存在并發(fā)揮抑炎作用，同時(shí)伴隨著CD206 的高表達(dá)[9]。盡管關(guān)于巨噬細(xì)胞表型變換的相關(guān)機(jī)制還沒(méi)有被完全揭示，但是有大量研究表明NF-κB 信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[10-11]。

基于大量關(guān)于香蘭素抑炎、抗炎的研究，提出疑問(wèn)，香蘭素是否也在巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用呢？其發(fā)揮抑炎、抗炎的機(jī)制又是怎樣的呢？基于這樣的疑問(wèn)設(shè)計(jì)了如下試驗(yàn)。首先使用LPS 處理巨噬細(xì)胞以構(gòu)建巨噬細(xì)胞活化模型，進(jìn)而參考其他研究使用香蘭素對(duì)活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理以評(píng)價(jià)香蘭素對(duì)巨噬細(xì)胞活化的抑制作用，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW164.7 細(xì)胞，購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

香蘭素（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibio，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；p65、P-p65、β-actin 一抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（Proteintech，美國(guó)）；CD11B、CD68 流式一抗（Abcame，美國(guó)）；TRIzol （Life Technologies，美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche，美國(guó)）；熒光染料（TAKARA，日本）；ECL 發(fā)光液（Millipore，美國(guó)）DAPI、LPS、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒增強(qiáng)型、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 RAW164.7 細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW164.7 巨噬細(xì)胞于10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每?jī)商靷鞔淮巍?/p>

1.4 香蘭素及LPS 處理巨噬細(xì)胞

將RAW164.7 細(xì)胞接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右時(shí)，使用10 μM LPS 處理6 h 構(gòu)建巨噬細(xì)胞活化模型[12]，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基；香蘭素處理組在巨噬細(xì)胞活化模型構(gòu)建成功后使用200 nM 香蘭素處理細(xì)胞4 h 后收集樣品[13]。

1.5 各組巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達(dá)量

各組細(xì)胞處理完成后使用Trizol 法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，測(cè)定濃度后將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后按25 μL 體系依次加入cDNA、IL-1β 與β-actin 上下游引物（見表1）、熒光染料及滅菌水，每組設(shè)置3 組重復(fù)，預(yù)混后放入PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化及表型

細(xì)胞吸去培養(yǎng)基后，使用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，棄上清。使用0.25%胰酶將細(xì)胞消化離心，1 mL PBS 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1，三組細(xì)胞分別加入CD11B 和CD68 抗體混勻，37 ℃下孵育30 min，預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次后裝入流式管內(nèi)，上機(jī)檢測(cè)。

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞系

表1 IL-1β 與β-actin 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification of IL-1β and β-actin

1.7 Western Blot 檢測(cè)p65 蛋白活化水平

各組細(xì)胞處理后棄去培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3 次，棄上清，加入含有1% PMSF 的RIPA裂解液并刮取細(xì)胞，4 ℃裂解20 min。裂解完全的細(xì)胞于4 ℃離心機(jī)內(nèi)12 000 ×g 離心5 min，吸取上清，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白體積并加入蛋白上樣緩沖液煮沸使蛋白質(zhì)變性。將30 μg 蛋白樣品加入到10%的預(yù)制膠中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。按照三明治樣將PAGE膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，使用5%的脫脂乳室溫封閉1 h，加入p65（使用TBST 按1∶100 比例稀釋），P-p65（使用TBST 按1∶100 比例稀釋），β-actin（使用TBST 按1∶1 000 比例稀釋）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 清洗5 次，二抗室溫下孵育1 h，TBST 清洗5 次，ECL 顯影液下進(jìn)行顯影，統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)量。

1.8 免疫熒光檢測(cè)p65 入核情況

細(xì)胞均勻接種在含有細(xì)胞爬片的24 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，各組進(jìn)行不同處理后，4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞2 h。PBST 清洗5 次，每次5 min，使用p65 一抗孵育過(guò)夜。使用PBST 清洗5 次，相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，再次使用PBST 清洗5 次后滴加含有DAPI 的抗淬滅劑，樹蠟封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察p65 位置。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)使用Graphpad Prism 7.0 軟件，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One -way ANOVA）法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 香蘭素處理后各組IL-1β mRNA 表達(dá)量

各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后使用熒光定量PCR 方法對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以評(píng)價(jià)香蘭素對(duì)巨噬細(xì)胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過(guò)香蘭素處理后，被LPS 活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達(dá)量顯著下降。

圖1 不同處理組細(xì)胞內(nèi)IL-1β mRNA 表達(dá)量Fig.1 IL-1β mRNA expression in each group.*P＜0.05，***P＜0.001

2.2 香蘭素處理后各組巨噬細(xì)胞活化水平及表型檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)處理后對(duì)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志物CD11B 以及M1 表型的標(biāo)志物CD68 進(jìn)行熒光染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)各組內(nèi)標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖2 所示，（A）為流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，圖中左下角為雙陰性細(xì)胞，右下角為CD11B 陽(yáng)性細(xì)胞，左上角為CD68 陽(yáng)性細(xì)胞，右上角為CD11B、CD68 雙陽(yáng)性細(xì)胞。（B）圖為各組內(nèi)CD11B 陽(yáng)性細(xì)胞率（右下角細(xì)胞量及右上角細(xì)胞量總和），（C）圖為CD11B 及CD68 陽(yáng)性細(xì)胞量（右上角）。與對(duì)照組相比，LPS 組CD11B 陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，LPS+香蘭素組無(wú)差異；同樣，與對(duì)照組相比，CD11B 及CD68 雙陽(yáng)性細(xì)胞在LPS 組顯著增加而LPS+香蘭素組差異不顯著。

圖2 不同處理組細(xì)胞內(nèi)CD11B 及CD68 熒光染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.2 CD68 and CD11B level measured by flow cytometry in each group

2.3 香蘭素處理后各組細(xì)胞內(nèi)NF-κB 中p65 亞基活化水平檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后使用Western bolt 方法對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)p65 亞基的磷酸化蛋白的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以評(píng)價(jià)香蘭素對(duì)巨噬細(xì)胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖3 所示，（A）圖為各組p65 蛋白磷酸化水平，（B）圖為各組蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組p65 亞基磷酸化水平顯著增加，經(jīng)過(guò)香蘭素處理后，被LPS 活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)磷酸化的p65 蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。

2.4 香蘭素處理后各組細(xì)胞內(nèi)NF-κB 中p65 入核現(xiàn)象檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后使用免疫熒光方法對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)p65 亞基的入核情況進(jìn)行觀察以評(píng)價(jià)香蘭素對(duì)巨噬細(xì)胞活化的抑制作用。結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，LPS 處理細(xì)胞后，p65 亞基均定位在核內(nèi)，而使用香蘭素處理后，p65 亞基大量定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖3 不同處理組細(xì)胞內(nèi)磷酸化p65 表達(dá)量Fig.3 p65 activated expression measured by western bolt in each group

圖4 不同處理組細(xì)胞內(nèi)p65 入核現(xiàn)象Fig.4 The level of p65 in nucleus measured by immunofluorescence in each group

3 討論

試驗(yàn)通過(guò)使用LPS 處理巨噬細(xì)胞構(gòu)建巨噬細(xì)胞活化模型，添加香蘭素以評(píng)價(jià)其抑炎、抗炎作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。結(jié)果顯示，添加香蘭素對(duì)LPS 誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制中可能是通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路內(nèi)p65亞基的活性，阻礙其入核從而達(dá)到抑制巨噬細(xì)胞活化的作用。

眾所周知，巨噬細(xì)胞活化后會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子以達(dá)到清除外來(lái)入侵物質(zhì)，協(xié)助機(jī)體進(jìn)行穩(wěn)態(tài)重構(gòu)的目的，在這其中，IL-1β 是巨噬細(xì)胞活化后釋放的首要細(xì)胞因子。大量研究表明，巨噬細(xì)胞活化后會(huì)釋放IL-1β 從而誘發(fā)內(nèi)源性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[14]。試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)使用LPS 處理巨噬細(xì)胞后，IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平顯著增加，而使用香蘭素處理后活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平被顯著抑制，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，試驗(yàn)結(jié)果初步表明香蘭素可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的活化，減少IL-1β 的合成。我們又對(duì)各組巨噬細(xì)胞活化標(biāo)記物CD11B 及M1 表型標(biāo)記物CD68 進(jìn)行熒光染色，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)活化的巨噬細(xì)胞及M1 表型數(shù)量加以統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，在使用LPS 處理后CD11B 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，而添加香蘭素后CD11B 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。不僅如此，CD68/CD11B 雙染結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS 組雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)極顯著增加，而LPS+香蘭素組雙陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)顯著性差異。CD11B 是免疫相關(guān)性細(xì)胞活化的主要標(biāo)記物，通過(guò)參與補(bǔ)體系統(tǒng)的活化過(guò)程發(fā)揮免疫細(xì)胞的粘附、遷移和吞噬功能并且放大了免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。CD68 作為B 類清道夫樣受體家族的一員是包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞在內(nèi)的免疫相關(guān)性細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[16]。盡管釋放炎性因子是巨噬細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，但巨噬細(xì)胞通過(guò)增加其表面相關(guān)受體的活化從而發(fā)揮其吞噬和粘附作用是巨噬細(xì)胞活化后的第一響應(yīng)信號(hào)，優(yōu)先于其炎性因子的釋放。因此，根據(jù)巨噬細(xì)胞表面吞噬和粘附相關(guān)受體的活化水平來(lái)判定巨噬細(xì)胞狀態(tài)更為直觀[17]。不僅如此，關(guān)于巨噬細(xì)胞M1 和M2 表型轉(zhuǎn)換的研究一直熱度不減，盡管并沒(méi)有完全闡明巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的相關(guān)機(jī)制，但是M1 型巨噬細(xì)胞的促炎功能和M2 型巨噬細(xì)胞的抑炎功能已被揭示[18]。在巨噬細(xì)胞活化后，大量的模式識(shí)別受體會(huì)迅速活化并對(duì)機(jī)體內(nèi)的一系列變化做出響應(yīng)，此時(shí)的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出的作用為“清除”和“識(shí)別”，為M1型；而在疾病的轉(zhuǎn)歸期，巨噬細(xì)胞的功能和角色又發(fā)生改變，表現(xiàn)為“修復(fù)”和“保護(hù)”，為M2 型。CD68 作為清道夫樣受體家族的一員在M1 表型的巨噬細(xì)胞中參與了大量的吞噬和識(shí)別過(guò)程，是M1 型巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)志之一[19]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞活化模型內(nèi)加入香蘭素后，其M1 表型標(biāo)記物CD68 及活化標(biāo)記物CD11B 數(shù)量均顯著下調(diào)，說(shuō)明巨噬細(xì)胞活化后其吞噬能力被顯著抑制，并且結(jié)合其IL-1β mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)這一試驗(yàn)結(jié)果，確定香蘭素可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞吞噬能力，下調(diào)其促炎因子的釋放的方式，阻礙由LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化及分化過(guò)程。

在明確了香蘭素對(duì)于LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化及分化的抑制作用后，我們又對(duì)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑炎、抗炎作用的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。使用Western blot 方法對(duì)NF-κB 通路內(nèi)p65 亞基的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，使用LPS處理后的巨噬細(xì)胞中p65 蛋白的磷酸化水平顯著增加；而在添加了香蘭素后這種升高趨勢(shì)被顯著抑制。不僅如此，免疫熒光結(jié)果顯示在LPS 刺激組，核內(nèi)p65 的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)而在使用了香蘭素后，定位于核內(nèi)的p65 熒光強(qiáng)度下降，表明LPS 可以增加p65的入核，而使用香蘭素后會(huì)顯著抑制其入核過(guò)程。NF-κB 信號(hào)通路作為天然免疫系統(tǒng)內(nèi)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子可被各種因素激活從而促進(jìn)包括各項(xiàng)炎癥因子及炎癥介質(zhì)在內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB 是由p65和p50 兩個(gè)同源二聚體亞單位構(gòu)成，在正常生理?xiàng)l件下與其抑制因子IκB 組成無(wú)活性的三聚體定位于細(xì)胞漿參與細(xì)胞的增值與分化過(guò)程，而當(dāng)接收到模式識(shí)別受體傳入至胞內(nèi)的信號(hào)后，包括IκBα 再內(nèi)的IκB 迅速?gòu)娜垠w上解離被泛素化酶體系統(tǒng)降解，喪失對(duì)p65 和p50 亞基的限制作用，而p65 和p50 亞基從三聚體單位上解離后，迅速暴露其絲氨酸及蘇氨酸殘基并通過(guò)磷酸化修飾增加其活性并迅速移位入核，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[20]。多項(xiàng)研究表明p65 的活化入核過(guò)程直接介導(dǎo)了包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫相關(guān)性細(xì)胞的活化[21]，而在使用香蘭素后Western blot 及免疫熒光結(jié)果均顯示p65 亞基的活化均被抑制，這可能直接參與了香蘭素的抑炎和抗炎過(guò)程，抑制巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化及活化過(guò)程。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果分析得出結(jié)論，香蘭素通過(guò)限制NF-κB 信號(hào)通路中的p65 活性，抑制巨噬細(xì)胞的活化及分化以達(dá)到其抗炎抑炎的效果。而在日后的畜禽集約化養(yǎng)殖過(guò)程中可以通過(guò)適當(dāng)?shù)奶砑酉闾m素以達(dá)到提升畜禽抗病能力、降低養(yǎng)殖成本的目的。

4 結(jié)論

試驗(yàn)中，通過(guò)LPS 處理巨噬細(xì)胞以構(gòu)建巨噬細(xì)胞活化模型并使用香蘭素處理后發(fā)現(xiàn)，香蘭素可通過(guò)作用于NF-κB 內(nèi)p65 亞基，通過(guò)抑制其磷酸化、阻礙其活入核最終達(dá)到其抗炎、抑炎的功能。