田 陽 饒 歡 薛文通

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083）

花生過敏是一種發(fā)病率高且難以治愈的過敏性疾病，嚴重時可引發(fā)皮炎、哮喘、呼吸困難乃至死亡。 據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內高達1%的兒童對花生過敏[1-2]?；ㄉ^敏在美國、加拿大、英國、以色列的兒童發(fā)病率分別達到了1.4%，1.7%，1.9%和0.2%。引發(fā)花生過敏的蛋白有17 種[4]， 其中含量最高（15%）的是Ara h 1[5]，研究顯示超過95%的中國患者血清可識別該蛋白[6]。 Ara h 1 是同源三聚體，由3 條分子質量均為63.5 ku 的肽鏈組成[7]。23個致敏表位分布在肽鏈交聯(lián)處，使其在熱加工、酶解乃至消化過程中仍能保持免疫活性[8]。 研究Ara h 1 的結構及特性，對明確花生致敏機理，生產低致敏花生制品具有重要意義。

如何實現(xiàn)Ara h 1 的有效提取及純化， 是后續(xù)研究的第1 步。 目前較為成熟的提純方法一般包括硫酸銨鹽沉淀、陰離子交換層析、凝膠排阻層析、親和色譜柱層析等流程[9-10]，持續(xù)時間較長，步驟繁瑣，且成本較高。 Ara h 1 在冗長的提純過程中容易降解或失活， 層析的過多更會降低目標蛋白的得率。 蛋白的重組表達可有效避免操作流程的繁瑣，提高純度與得率，降低純化成本。 重組蛋白的基因序列與天然蛋白一致，在結構、功能特性方面與天然蛋白差異較小[11]。 此外，使用重組技術生產的低致敏性蛋白被應用于口服免疫治療實驗中[12]，取得了良好的治療效果。 重組致敏蛋白在研究致敏原結構表征[13]、致敏原檢測[14]、致敏機理以及抗敏疫苗[15]的開發(fā)等方面正在被愈加廣泛的應用。

現(xiàn)有研究表明， 重組Ara h 1（recombinant Ara h 1， rAra h 1）的制備過程仍存在技術難題。 由于原核表達系統(tǒng)與植物源蛋白之間的遺傳特性差異較大，所以rAra h 1 在大腸桿菌中的表達程度較低，且易形成包涵體，難以釋放在裂解液上清中。蛋白在裝配過程中較易錯誤折疊，形成低分子質量的變體，使得rAra h 1 的純化變得較為困難。本研究針對以上問題，對基因工程菌誘導過程、菌體裂解條件、蛋白純化流程進行優(yōu)化，逐步建立高效的rAra h 1 制備方法，為進一步開展致敏原的結構及生物活性研究提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

pET-32a（+）Ara h 1 重組質粒，由生工生物工程（上海）公司合成。大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS 感受態(tài)細胞，北京全式金生物公司。限制性核酸內切酶SacI/NotI，TAKARA 工程有限公司。 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂糖、氨芐青霉素粉末、甘油，北京均利博生物有限公司。 異丙基硫代半乳糖苷 （isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-100）、 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、 十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、 十二烷基磺酸鈉（Sodium laurylsulfonate，SLS）、 咪唑、 二硫蘇糖醇 （DLDithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、溶菌酶，北京全式金生物公司。Ni-NTA，Qiagen 公司。SDS-PAGE 分離膠緩沖液（4×，pH 8.8）、SDS-PAGE 濃縮膠緩沖液（4×，pH 6.8）、蛋白上樣緩沖液，索萊寶公司。TMB 試劑盒，生工生物工程（上海）公司。 Ara h 1 多克隆抗體，由英國曼徹斯特大學提供。

1.2 儀器與設備

UV-1200 紫外-可見分光光度計，美析儀器有限公司；迷你型蛋白電泳儀，美國Bio-Rad 公司；超聲波細胞破碎儀， 寧波新芝生物技術公司；THZ-82 恒溫水浴振蕩器， 常州國華電器有限公司；SHP-80 細菌培養(yǎng)箱， 林茂科技有限公司；5804R 冷凍離心機， 德國Eppendorf 公司；BHC-1304IIB2 生物安全柜， 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pET-32a-Ara h 1 重組質粒的制備與鑒定

通過NCBI GENE BANK 數(shù)據(jù)庫查得Ara h 1的基因編號為AF432231.1， 其編碼區(qū)共有1 895個堿基。在Ara h 1 核酸序列末端插入6×his 標簽和終止密碼子，序列兩端分別添加SacI 和NotI 酶切位點。 重組質粒的構建及檢驗測序交由生工生物工程（上海）公司完成，保證目標基因的準確插入。

1.3.2 Ara h 1 基因的誘導表達

1）大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 的轉化與篩選 感受態(tài)細胞在冰上融化，每100 μL 感受態(tài)細胞中加入20 ng pET-32a-Ara h 1 或空載質粒，輕輕旋轉幾次混勻內容物，在冰上放置30 min。將混合后的感受態(tài)細胞放入預加溫至42 ℃的循環(huán)水浴中，放置80 s，不可搖動。 快速將離心管轉至冰浴，使細胞冷卻1～2 min。 將感受態(tài)細胞與800 μL LB 培養(yǎng)基混合，37 ℃搖床溫育45 min， 使細胞復蘇并表達目標基因，溫和搖動細胞。分別取轉化pET-32a-Ara h 1 和空載質粒的菌液， 均勻涂布于含有50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板（直徑90 mm）上進行菌株篩選。 倒置培養(yǎng)皿，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h 后即可觀察到有白色的菌落， 即轉化子。分別挑取單克隆3 個，在LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。

2）目標基因的誘導表達 在50 mL 離心管中加入10 mL LB 培養(yǎng)基及0.5 mg 氨芐青霉素，按照1/100 的體積比分別加入轉化子菌液，37 ℃培養(yǎng)3.5 h。取1 mL 混合的菌液測量OD600，當該值等于0.6 時，留下2 mL 未誘導的菌液作為空白對照， 其余菌液加入300 mmol/L IPTG 后分別在16℃和22 ℃誘導6，20，22 h。 誘導完成后對菌液及空白對照進行4 ℃離心（5 000 g，50 min），留下菌體后用蛋白上樣緩沖液進行裂解， 并使用SDSPAGE 鑒定其表達效果。

1.3.3 菌體裂解條件的優(yōu)化 使用優(yōu)化的誘導條件大量誘導大腸桿菌BL21 （DE3）pLysS， 在每100 mL 菌液離心得到的菌體中加入10 mL 裂解液（配方見表1），將裂解液插在冰盒中，使用超聲波細胞粉碎儀裂解細胞，釋放蛋白，直至裂解液變得澄清透亮。 該過程保持低溫， 以免蛋白受熱變性。 將裂解液4 ℃離心（10 000 g，40 min）后，分別取上清和沉淀制備成電泳樣品，在SDS-PAGE 中檢測裂解后的目標蛋白表達情況。

1.3.4 重組蛋白rAra h 1 的純化

1）Ni-NTA beads 預洗 取400 μL Ni-NTA，置于15 mL 尖頭離心管中， 離心棄保存液。 加入10 mL 裂解液使其處于穩(wěn)定緩沖體系，快洗2 次，慢洗1 次（快洗：上、下輕柔顛倒混勻幾次，離心力為400 g，4 ℃離心2 min，棄上清；慢洗：旋轉培養(yǎng)10 min，離心，離心條件同快洗）。

2）蛋白與Ni-NTA beads 孵育 在預洗過的Ni-NTA beads 中加入10 mL 蛋白上清液， 分別4℃旋轉培養(yǎng)40 min、2 h、3 h，4 ℃離心（10 000 g，20 min），棄上清。 使用洗液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪 唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L ED-TA，1 mmol/L DTT，0.4% Triton-100，2%丙三醇，pH 7.4）將吸附蛋白后的Ni-NTA 快洗2 次，慢洗1 次。 洗完后取出10 μL Ni-NTA，加入蛋白上樣緩沖液， 做SDS-PAGE 檢測Ni-NTA beads 吸附情況。

表1 6 種裂解液配方Table 1 Composition of six kinds of lysis buffer

3）梯度洗脫 取出300 μL Ni-NTA beads于1.5 mL EP 管中，4 ℃離心棄上清。 加100 μL洗脫液A （20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.4% Triton-100，10%丙三醇，pH 7.4）洗脫兩次。 每次洗脫時4 ℃旋轉孵育1 h，4 ℃離心（600 g）2 min， 得上清置于新的1.5 mL EP 管中。后繼續(xù)在Ni-NTA beads 中加入100 μL 洗脫液B（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.4%Triton-100，10% 丙三醇，pH 7.4）洗脫兩次，步驟同上。 收集洗脫后的上清液，通過SDS-PAGE 檢測洗脫液中蛋白種類。

1.3.5 質譜鑒定純化蛋白的種類 純化的蛋白經SDS-PAGE 后割下目標條帶送至北京邦非生物科技有限公司進行MALDI TOF/TOF 質譜鑒定。 氨基酸序列比對使用MASCOT （Matrix Sciences，英國）軟件系統(tǒng)分析。

1.3.6 免疫印跡測定rAra h 1 免疫活性 參考Rao 等[16]的方法，純化蛋白經SDS-PAGE 后轉膜至PVDF 上（80 mA，300 V，90 min），用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉（37 ℃，2 h），洗膜3 次，每次5 min，然后將PVDF 膜與1∶5 000（體積比）稀釋的Ara h 1 抗體在4 ℃條件下孵育過夜，洗膜后加入1：5 000（體積比）稀釋的HRP 酶標羊抗兔IgG 二抗，37 ℃溫育2 h。 洗膜后使用TMB 試劑盒顯色。

2 結果與分析

2.1 pET-32a-Ara h 1 重組質粒的鑒定

通過使用限制性內切酶Sacl 和Notl 切割重組質粒，并對其產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。 1 號泳道中出現(xiàn)兩條明顯的條帶，表明基因重組質粒構建時并未插入其它雜質基因。 其中5 900 bp 的條帶為pET-32a 載體，1 895 bp 左右的條帶為目標基因帶， 目標帶的分子質量數(shù)值符合NCBI 數(shù)據(jù)庫中Ara h 1 蛋白的數(shù)據(jù)。

圖1 瓊脂糖電泳鑒定pet-32a（+）Ara h 1 重組質粒Fig.1 Identification of pet-32a （+）Ara h 1 recombinant plasmid by agarose electrophoresis

精準插入目的基因是評價重組質粒構建成功的重要指標， 也是保證后期目標基因成功表達的重要步驟。 此處通過對重組質粒中的目標基因分子質量、序列進行比對，確認重組質粒的專一性和準確性，為開展下一步試驗奠定基礎。

2.2 目標蛋白在大腸桿菌中的表達情況鑒定

使用SDS-PAGE 鑒定轉化后的大腸桿菌是否成功表達rAra h 1。 如圖2a 所示，與泳道1、3、5 相比， 泳道2、4、6 中明顯多出1 條分子質量約為110 ku 的條帶，該條帶亮度較高，是目標基因的表達產物。由此可見，質粒轉化后的克隆子均可表達目標基因。與天然Ara h 1 相比，重組Ara h 1 的分子質量增加了46.5 ku。 這主要是由于在pET-32a 標準載體中，啟動子之后增加了Trx-tag、His-tag、S-tag 以及9 個酶切位點， 共計1 162 個堿基。多翻譯出的序列中包含388 個氨基酸，其分子質量約為46.56 ku， 造成重組蛋白分子質量較高。經課題組試驗表明，該蛋白的分子結構及致敏性均與天然Ara h 1 蛋白具有較高的一致性[17]，可用于下一步的改性及降敏研究。 相比于泳道2和6，泳道4 中的目標帶亮度更高，說明克隆子2號中目標基因的表達效率為最高。 由此選擇克隆子2 號擴大培養(yǎng)，大量生產目標蛋白并進行純化。

根據(jù)圖2b 中的結果，24 ℃，24 h 誘導后的克隆子2 號，可大量表達目標蛋白（泳道A 中有明顯的110 ku 條帶）， 而菌體裂解液上清中卻只有很少的目標蛋白 （泳道B 中110 ku 處幾乎沒有條帶）。 泳道C 中目標帶的含量較多，表明大部分目標蛋白被包裹在包涵體內，難以溶解在裂解液中。使用Ni-NTA 對目標蛋白進行吸附和洗脫， 結果如泳道D、E 所示，鎳柱無法和裂解液上清中目標蛋白結合， 反而與分子質量約為100 ku 和40 ku等的雜蛋白結合。 這是由于大腸桿菌的誘導條件不適宜，目標蛋白的表達量過少，裂解液上清中的目標蛋白含量顯著少于鎳柱， 導致鎳柱無法有效識別重組蛋白， 轉而與雜帶結合。 為了提高rAra h 1 的表達效率，使其在裂解液上清中得到釋放，對大腸桿菌的誘導條件及菌體裂解條件進行研究。

圖2 質粒在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 中的表達Fig.2 Expression of plasmid in Escherichia coli BL21（DE3）pLysS

2.3 菌體誘導條件、裂解條件變化對重組蛋白表達量及可溶性的影響

高溫短時誘導大腸桿菌雖然可使菌體生長較快，但易造成重組蛋白過度折疊及形成包涵體[18]。由此，選擇22，16 ℃分別誘導6，20，22 h。 誘導完后裂解菌體，檢測裂解液上清中的重組蛋白含量，結果如圖3 所示。圖3a 中泳道1、2、3 中110 ku 的蛋白亮度顯高于泳道4、5、6， 說明相比于16 ℃和22℃誘導可使重組蛋白獲得較高表達量。 此外，泳道2 中的rAra h 1 含量在6 條泳道中為最高，由此確定了22 ℃誘導22 h 為大腸桿菌的最佳誘導條件。

將大量誘導后的菌體進行裂解，結果如圖3b所示。相比于泳道A，泳道B 中目標蛋白的表達量較高，說明誘導條件合適。 泳道C 與泳道D 中均存在分子質量為110 ku 的條帶，說明優(yōu)化誘導條件后，目標蛋白形成包涵體的含量減少，重組蛋白已部分溶解在裂解液上清中。

為了增加重組蛋白的可溶性， 使用6 種配方的裂解液對菌體進行裂解，結果如圖4 所示。鹽溶作用可以破壞蛋白分子表面的水膜， 增加分子表面的電荷，促使蛋白分子與鈉離子競爭水分，從而提高溶解效率。 裂解液1、2、3 號中氯化鈉濃度逐步上升，而泳道3、5、7 中分子質量為110 ku 的蛋白亮度并未增加， 推測鹽溶作用不能使rAra h 1溶解， 因此本試驗中將裂解液中的氯化鈉濃度確定為較低的200 mmol/L，以免造成蛋白質變性。裂解液4、5、6 號中添加了十二烷基磺酸鈉（SLS）作為陰離子表面活性劑，以提高目標蛋白的親水性。根據(jù)圖4 顯示， 泳道9、11、13 中分子質量為110 ku 的蛋白條帶亮度增加，說明添加SLS 可增強目標蛋白的可溶性。與泳道12 相比，泳道14 中目標蛋白的含量明顯下降， 說明增加SLS 的濃度可抑制包涵體的形成， 提高重組蛋白在裂解液上清中的表達效率。 據(jù)本課題組研究經驗，SLS 的濃度過大會抑制his 標簽蛋白與Ni-NTA 的結合，因此在裂解液中配方中添加15 mmol/L SLS，在提高蛋白可溶性的同時避免純化時蛋白與Ni 柱結合的效率過低。

圖3 誘導條件對rAra h 1 表達及純化的影響Fig.3 Effect of inducing conditions on the expression and purification of rAra h 1

圖4 不同配方裂解液中rAra h 1 的溶解度變化Fig.4 The solubility change of rAra h 1 in different lysis buffers

2.4 重組蛋白純化條件的優(yōu)化

將裂解液上清與Ni 柱共孵育，通過控制孵育時間的長度，使得雜質蛋白結合較少[19]。 本試驗選取40 min，2 h，3 h 3 個時間點終止孵育， 并對Ni柱進行洗脫。使用SDS-PAGE 對目標蛋白與Ni 柱的結合效率、 洗脫結果進行檢測， 結果如圖5 所示。 圖5a 中， 泳道3、5、7 中均出現(xiàn)分子質量為110 ku 的目標蛋白以及90 ku 和22 ku 的兩條蛋白雜帶，泳道4、6、8 分別是其對應的洗脫結果。與泳道5、7 相比，泳道3 中約90 ku 和約22 ku 的雜蛋白條帶亮度較低， 這是由于蛋白液（裂解上清液）與Ni 柱結合時間越短，雜蛋白越難掛柱。本試驗最終選擇40 min 為Ni 柱結合時間。

圖5 孵育時長和梯度洗脫對rAra h 1 純化效果的影響Fig.5 The influence of binding time and gradient elution on the purification of rAra h 1

使用梯度咪唑洗脫液洗脫可以控制Ni 柱中結合位點的數(shù)量， 從而對目標蛋白的結合效率進行調整，進而獲得純化的重組蛋白。 本試驗中，分別采用50 mmol/L 和100 mmol/L 的洗脫液對結合蛋白后的鎳柱洗脫2 次， 并對洗脫過程中鎳柱結合蛋白的情況做SDS-PAGE 檢測。 如圖5b 所示，泳道F、G 中雜帶含量最低，說明梯度洗脫過程中，使用100 mmol/L 咪唑洗脫蛋白可獲得較佳的純化效果。

2.5 重組蛋白的鑒定與免疫性評價

使用SDS-PAGE 檢測誘導前、 后菌體表達蛋白，裂解后上清液，沉淀，結合蛋白后的鎳柱以及100 mmol/L 咪唑洗脫液中的蛋白，結果如圖6a 所示。泳道5、6、7 中110 ku 的目標蛋白含量高且雜帶少，表明rAra h 1 的純化流程效率較高。 使用質譜鑒定分子質量110 ku 蛋白條帶是否與Ara h 1 氨基酸序列相符合， 結果如圖6b 所示， 共有9條標志性肽段與Ara h 1 相符，重組蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Ara h 1 氨基酸匹配分值達到426，鑒定該條帶即重組Ara h 1 蛋白。

使用western-blot 評價重組蛋白的免疫原性，結果如圖6c 所示。 泳道B、C、D、E 中成功表達的重組蛋白均可與anti-Ara h 1 抗體結合， 說明重組蛋白具有與Ara h 1 抗體結合的能力并保持良好的免疫活性。

圖6 rAra h 1 純化結果鑒定及Western-Blot 分析Fig.6 The identification and western-blot analysis of rAra h 1

3 討論

重組過敏原不僅保留了天然過敏原的抗原性，而且易于制備，方便改性，已廣泛應用在過敏原檢測和口服免疫治療疫苗的生產[20-21]。重組蛋白技術可以針對致敏原的線性表位做出定點氨基酸改變，從而靶向改變致敏原的一級結構，獲得低致敏性衍生物。 這些低致敏衍生物可在表現(xiàn)較低的IgE 結合能力的同時，保留T 細胞反應活性，因此可用于特異性免疫治療[22-23]。

隨著重組致敏原在過敏病癥診斷、 治療等方面的廣泛應用， 重組技術的優(yōu)化也愈加成為研究熱點。目前，已有學者報道Ara h 1、Ara h 2、Ara h 6 的重組制備技術[9，24-26]，由于表達載體不同，目標基因序列插入位點不同，所帶標簽不同等原因，所以各種制備方式存在較大差異， 目標基因表達的效率也各不相同。例如，Gregory 等[27]使用萊茵衣藻制備Ara h 1 和Ara h 2， 雖然表達效率較高，但是重組蛋白的免疫性與天然蛋白相差較大。Lew等[28]對Ara h 2.02 進行密碼子優(yōu)化，使其在大腸桿菌中的表達效率增加，通過親和層析、蛋白變性和復性等流程對不可溶的重組蛋白進行純化，操作過程涉及步驟較為繁瑣。 閆飛等[9，29]采用RTPCR 獲得Ara h 1 基因，構建重組質粒pET-32a-Ara h 1，優(yōu)化大腸桿菌誘導條件后，利用親和純化獲得rAra h 1。 本試驗前期曾嘗試采用該研究條件進行誘導和蛋白純化， 然而由于質粒構建不同，重組蛋白的可溶性始終較低，對后續(xù)純化工作造成一定困難。 本研究通過對重組Ara h 1 蛋白工藝中的菌體誘導條件、純化條件等重新優(yōu)化，得到高效的制備方法， 為后期針對重組Ara h 1 展開結構及生物活性研究奠定了基礎。

在制備重組蛋白時， 目標基因的表達很容易形成包涵體，不能溶解在裂解液上清中。這多是因植物源蛋白的遺傳信息與原核表達系統(tǒng)相差較大，基因工程菌的誘導條件不適宜所致。若要純化包涵體中的蛋白，則需要變性、復性等一系列操作[18，30]。 對于致敏蛋白而言，變性與復性可能導致蛋白結構發(fā)生改變，進而使過敏原喪失免疫原性。如何促使目標蛋白在裂解液上清中大量表達，是亟需解決的關鍵問題。研究結果表明，改變裂解液的pH 值，使其遠離目標蛋白的等電點，調整裂解液中鹽離子的濃度促進重組蛋白的鹽溶， 添加陰離子交換劑改善蛋白與水分子的結合效率等措施都可增加重組蛋白的可溶性[31-32]。重組蛋白的制備過程中，誘導條件的確定，菌體裂解液、鎳柱平衡液和洗脫液的配方選擇尤為重要。 本研究針對以上條件進行研究， 結果表明：300 mmol/L IPTG 于22 ℃誘導菌液22 h 時蛋白表達量最高； 添加15 mmol/L 十二烷基磺酸鈉可將蛋白釋放在上清液中， 使用含50 mmol/L 和100 mmol/L 咪唑洗脫液分別洗脫2 次和1 次， 可得到純度較高且免疫原性良好的重組Ara h 1。 rAra h 1 高效制備方法的確定可為之后研究Ara h 1 結構、致敏力變化、致敏機制以及低致敏衍生物的生產提供技術基礎。