閆 爽 楊 波 趙建新 張 灝 陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫214122）

雙歧桿菌（Bifidobacteria）是人體腸道菌群中一類重要的優(yōu)勢(shì)微生物， 與其宿主之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系[1]。某些特定的雙歧桿菌菌株被證明具有拮抗腸侵襲性致病菌，抑制結(jié)直腸癌，抑制炎癥性腸病以及緩解便秘等功能[2-5]。

盡管有大量關(guān)于人體腸道微生物組成的研究， 然而關(guān)于腸道共生菌和宿主相互作用的分子機(jī)制還不十分明確[6]。 有研究提出，共生菌的細(xì)胞被膜成分，包括蛋白質(zhì)和碳水化合物，是微生物與其宿主之間發(fā)生相互作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7-9]。 胞外多糖是由一些特定菌株產(chǎn)生的一類碳水化合物聚合物，可附著于菌體表面形成一層被膜（莢膜多糖）或者釋放到周圍環(huán)境中[10]。 雙歧桿菌的莢膜多糖可通過改變菌體表面的物理性質(zhì)維持菌體與宿主的共生關(guān)系。此外，某些雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）可提高菌體對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受性， 保護(hù)菌體免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，同時(shí)可對(duì)宿主產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)等多種作用[11-12]。雙歧桿菌所產(chǎn)的EPS 可能是其發(fā)揮益生功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[13]。

短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acid，SCFA）是人體腸道菌群的重要代謝產(chǎn)物， 具有為腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和礦物質(zhì)吸收，緩解腹瀉與便秘，抑制致病菌等多重生理活性[14]。近年來大量研究表明， 短鏈脂肪酸具有免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用[9]。 雙歧桿菌所產(chǎn)的短鏈脂肪酸主要為乙酸， 它可保護(hù)宿主免受腸道致病菌感染， 同時(shí)可被腸道中產(chǎn)丁酸菌利用產(chǎn)生丁酸，發(fā)揮抗炎等生理活性[2，15]。

本研究從嬰幼兒、 成年人和老年人的糞便中篩選長(zhǎng)雙歧桿菌（B. longum），分析不同菌株的體外特性，包括生長(zhǎng)特性、糖發(fā)酵特性、產(chǎn)短鏈脂肪酸和胞外多糖的能力， 并比較菌株胞外多糖合成關(guān)鍵基因——引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶（Priming glycosyltransferase，pGT）基因的序列及其進(jìn)化關(guān)系，為雙歧桿菌特定菌株的篩選以及胞外多糖相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共采集38 份不同年齡段健康志愿者的糞便樣品。 其中男性20 名，女性18 名；小于3 歲的嬰幼兒14 名，30～50 歲的中年人11 名， 大于60 歲的老年人13 名。將采集的糞便樣品置于50 mL 無菌離心管中，添加30 mL 滅菌的30%甘油溶液（含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽）混勻，在4 ℃下暫時(shí)保存，并于48 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃條件下保藏。

1.2 主要試劑和設(shè)備

MRS 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸、苯酚，國(guó)藥集團(tuán)；莫匹羅星、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；2×Taq MasterMix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； 細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F （5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R （5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′），上海桑尼生物科技有限公司；阿拉伯樹膠、阿拉伯糖、纖維二糖、D-葡萄糖胺、D-葡萄糖醛酸酯、D-甘露糖、 松三糖、D-木糖， 美國(guó)sigma公司；低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖，上海源葉生物科技有限公司。本試驗(yàn)所用MRS 培養(yǎng)基在配制時(shí)均添加0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。

超低溫冰箱， 美國(guó)Thermo scientific 公司；超凈工作臺(tái)， 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；Whitley DG250 厭氧工作站， 英國(guó)Don Whitley Scientific公司；PCR 熱循環(huán)儀， 美國(guó)Biorad 公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞破碎儀， 寧波新芝生物科技股份有限公司，UV1800 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 雙歧桿菌的分離純化

凍存的糞便樣品在室溫下融化，混勻。將糞便懸液用無菌生理鹽水以10-1梯度稀釋。 選取適當(dāng)稀釋度的稀釋液涂布MRS 平板（添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和100 mg/L 莫匹羅星）， 置于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)72 h。長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同形態(tài)的菌落繼續(xù)劃線純化，最終得到純培養(yǎng)物，擴(kuò)增16s rDNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序以確定物種，并保藏菌種。

1.4 生長(zhǎng)曲線的繪制

待測(cè)菌株在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)3 代后，以2%的接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基 （添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽）中，于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)。 培養(yǎng)過程中每2 h 取樣1 次，測(cè)定發(fā)酵液的pH 值和波長(zhǎng)600 nm 處的OD 值， 直至進(jìn)入穩(wěn)定期。

1.5 對(duì)數(shù)末期菌落數(shù)的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的發(fā)酵液， 用無菌生理鹽水以10-1梯度稀釋， 選取適當(dāng)稀釋度的稀釋液涂布MRS 平板，置于37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)72 h。 長(zhǎng)出單菌落后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。發(fā)酵液中的菌落數(shù)以CFU/mL 表示。

1.6 糖發(fā)酵特性分析

將不同種類的糖配制成溶液， 用0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌，以1 g/L 的質(zhì)量濃度添加到不含糖的MRS 液體培養(yǎng)基中，另添加少量溴甲酚紫溶液， 作為酸堿指示劑。 待測(cè)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期， 離心收集菌體， 用無菌生理鹽水吹洗菌體2次，用等體積的生理鹽水重懸菌體，以2%的接種量將菌懸液接種到上述含不同碳源的MRS 培養(yǎng)基中，在37 ℃的厭氧工作站中培養(yǎng)24～48 h，記錄培養(yǎng)基的變色情況。 雙歧桿菌能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，雙歧桿菌不能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基仍未紫色，由此判斷菌株能否利用相應(yīng)的糖。 以含葡萄糖的MRS 培養(yǎng)基和不含糖的MRS 培養(yǎng)基分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.7 發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸的測(cè)定

將菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，6 000×g 離心10 min， 上清液用于測(cè)定短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸）的含量。短鏈脂肪酸的提取和GC-MS 測(cè)定參考Mao等[16]的方法。 采用外標(biāo)法計(jì)算各短鏈脂肪酸的質(zhì)量摩爾濃度， 最終結(jié)果以單位生物量產(chǎn)生的短鏈脂肪酸表示（μmol/g 生物量）。

1.8 胞外多糖的測(cè)定

胞外多糖的測(cè)定分為細(xì)胞表面多糖（EPS-b）測(cè)定和游離胞外多糖（EPS-r）測(cè)定。將雙歧桿菌菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期， 取10 mL 發(fā)酵液，6 000×g 離心15 min，收集菌泥和上清液分別用于測(cè)定EPS-b 和EPS-r。 胞外多糖的提取和測(cè)定參考Tallon 等[10]的方法。 測(cè)定結(jié)果以單位生物量產(chǎn)生的EPS 毫克數(shù)表示（mg/g 生物量）

1.9 引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶 （pGT）基因的PCR 擴(kuò)增、測(cè)序和生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)， 長(zhǎng)雙歧桿菌的pGT 基因分為cpsD 基因和rfbP 基因。 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列， 設(shè)計(jì)pGT 基因特異性引物如下：cpsD-F （5'-TTCTCYGTGCGCATGGAATC-3′）和cpsD-R（5'-CCCATAATSGACCAGTTCTGCAC-3′）；rfbP-F（5'-GATTCYGAGACCATGCGTAC-3′）和rfbP-R（5'-GCATARTCCGACTGTTCCTGAG -3′）。 待測(cè)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA。以細(xì)菌基因組DNA 為模板， 采用pGT 基因特異性引物PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序，所得序列用Clustal X2 軟件比對(duì)，用MEGA5.1 軟件的neighbor-joining 方法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。 選取標(biāo)準(zhǔn)菌株長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705 的pGT 序列作為參考序列。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)均做3 次重復(fù)試驗(yàn)， 所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)用于分析組間顯著性差異，P＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的生長(zhǎng)特性

根據(jù)16s rDNA 序列比對(duì)結(jié)果，選取38 株分離自不同糞便樣品的長(zhǎng)雙歧桿菌（表1）做后續(xù)分析。

表1 篩選出的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株及其宿主信息Table 1 Isolated strains and the information of their corresponded hosts

由于不同菌株對(duì)代謝底物的利用能力不同，其生長(zhǎng)速率存在差異， 因此首先測(cè)定各菌株在MRS 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。 由圖1a 可知，不同菌株在MRS 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性具有顯著差異。 整體來看，嬰幼兒源菌株的生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢，延遲期為6～8 h； 而老年人源的菌株生長(zhǎng)速率相對(duì)較快，延遲期為4～6 h，其中HUB6-1 的延遲期只有2 h，10 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期， 而其它多數(shù)菌株在20 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。 另外，進(jìn)入穩(wěn)定期后，各菌株發(fā)酵液的OD 值也有顯著差異，嬰幼兒源菌株的OD值整體低于老年人源菌株的OD 值， 對(duì)各菌株對(duì)數(shù)末期活菌數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果也顯示， 嬰幼兒源菌株的CFU 值顯著低于老年人源的菌株（圖1b）。 然而， 不同性別人群來源的菌株之間沒有類似的差異性。 該結(jié)果可能是由于不同年齡宿主來源的菌株在體外培養(yǎng)條件下對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用能力存在差異所致。

2.2 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株對(duì)碳源的利用特性

根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)所述， 長(zhǎng)雙歧桿菌又分為長(zhǎng)亞種（B. longum subsp. longum）、嬰兒亞種 （B. longum subsp. infantis）和豬亞種（（B.longum subsp. suis）， 不同亞種間通過16s rDNA序列很難區(qū)分。 由于不同亞種在糖發(fā)酵特性上存在差異， 因此菌株的發(fā)酵特性可以作為區(qū)分亞種的方法。圖2 列出38 株長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)不同碳水化合物的利用情況。 由圖2 可知，只有FHeNJZ44M8不能利用阿拉伯糖而可以利用D-葡萄糖醛酸酯。根據(jù)伯杰氏手冊(cè)， 作者認(rèn)為該菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。有研究提出，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種可分為2 種亞型（biovar），其中亞型A 可以發(fā)酵甘露糖，而亞型B 不能發(fā)酵甘露糖[17]。 本研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒來源的菌株多數(shù)可以利用甘露糖，14 株菌株中只有2 株不能利用甘露糖；而成年人來源的24 個(gè)菌株中，只有6 株可以利用甘露糖。多數(shù)菌株可以發(fā)酵本試驗(yàn)中的3 種低聚糖， 只有C1-A13、FJSNT70M6、RG2-33 菌株對(duì)低聚糖的利用能力較差。多數(shù)菌株不能利用阿拉伯樹膠、纖維二糖和D-葡萄糖胺。

圖1 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of different strains in MRS broth

2.3 不同長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵上清液中SCFA 的組成

各菌株發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸的組成如圖3a 所示。 長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵上清液中主要的短鏈脂肪酸為乙酸，另有極少量的丙酸、丁酸和戊酸，后幾種短鏈脂肪酸的含量與新鮮MRS 培養(yǎng)基中的含量基本一致，因此可認(rèn)為雙歧桿菌在MRS 培養(yǎng)基中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸只有乙酸， 扣除培養(yǎng)基中本身存在的乙酸， 即得各菌株產(chǎn)乙酸的能力（圖3b）。 雙歧桿菌對(duì)六碳糖的代謝途徑為“雙歧桿菌途徑”（Bifidus pathway）， 代謝產(chǎn)物主要為乙酸和乳酸，二者比例為3∶2[17]。 乙酸是雙歧桿菌的主要代謝產(chǎn)物之一， 它在保護(hù)腸道免受侵襲性治病感染方面起到重要作用[2]。不同菌株之間產(chǎn)乙酸的能力有一定的差異， 其中HUB37-A12、C1-A13、HAN4-25 短鏈脂肪酸的產(chǎn)量明顯高于其它菌株，而不同年齡以及性別人群來源的菌株間并沒有呈現(xiàn)規(guī)律性差異。

圖2 各菌株對(duì)不同碳水化合物的利用情況Fig.2 Carbohydrates fermentation test of different strains

圖3 不同菌株發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸（SCFA）的組成Fig.3 Composition of SCFA in culture supernatant of different strains

2.4 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的胞外多糖產(chǎn)量

胞外多糖作為腸道微生物與宿主腸道之間相互作用的重要介質(zhì)， 對(duì)于宿主具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。 本研究測(cè)定了不同菌株的菌體表面多糖（EPS-b）和游離胞外多糖（EPS-r）的產(chǎn)量。 由表2可知， 不同菌株之間胞外多糖的產(chǎn)量具有明顯差異。 其中CCFM760、HUB37-A12、HAN4-25 幾乎不產(chǎn)胞外多糖， 而HUB2-1 和HUB6-1 被檢測(cè)到表面胞外多糖（EPS-b）。 另外，將菌株按照宿主年齡分組后發(fā)現(xiàn)， 嬰幼兒來源菌株的細(xì)胞表面多糖（EPS-b）產(chǎn)量低于中年人和老年人來源菌株，3 組的平均值分別為9.93，21.13，22.58 mg/g，其中嬰幼兒源和老年人源菌株的細(xì)胞表面多糖（EPS-b）產(chǎn)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05）（圖4）。這些特性的差異可能與不同來源的菌株適應(yīng)其宿主腸道環(huán)境有關(guān)[18-19]。而不同性別人群來源的菌株之間沒有規(guī)律性差異。

圖4 不同年齡段宿主來源菌株的胞外多糖產(chǎn)量Fig.4 EPS production of strains from hosts with different ages

表2 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株胞外多糖的產(chǎn)量Table 2 EPS productions of different strains

2.5 不同長(zhǎng)雙歧桿菌菌株pGT 基因測(cè)序及進(jìn)化分析

引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶是參與胞外多糖合成過程第1 步反應(yīng)的酶。 不同菌株pGT 基因的C 端具有較高的保守性， 且在胞外多糖合成過程中參與脂質(zhì)載體和糖基的識(shí)別[20]，因此根據(jù)該基因C 端序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)C 端的核酸序列測(cè)序，并對(duì)相應(yīng)的氨基酸序列比對(duì)分析[20-21]。 除CCFM688 和M2-CF01-142 株菌外，其它36 株菌均通過該引物被檢測(cè)到pGT 基因。 這可能是由于這2 株菌的pGT 基因序列與其它pGT 基因序列的相似性較低， 無法利用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增所致[22]。 由圖5 可知，擴(kuò)增得到的長(zhǎng)雙歧桿菌pGT 的C 端具有較高的保守性。 根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果（圖5），這些序列可以分為3 組： 第1 組中主要為中年人和老年人源菌株的序列， 第2 組中主要為嬰幼兒源菌株的序列， 而第3 組中主要為老年人源的菌株的序列。不同性別人群來源的菌株沒有呈現(xiàn)聚類現(xiàn)象。

圖5 不同菌株引導(dǎo)型糖基轉(zhuǎn)移酶（pGT）C 端氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹Fig.5 Alignment and phylogenetic tree of amino acid sequence of the carboxy terminus of priming glycosyltransferase of different strains

3 結(jié)論

從不同年齡志愿者的糞便樣品中分離38 株長(zhǎng)雙歧桿菌，并分析各菌株的部分體外特性，包括生長(zhǎng)曲線、碳水化合物利用試驗(yàn)、發(fā)酵上清液中短鏈脂肪酸組成、 胞外多糖產(chǎn)量和胞外多糖合成關(guān)鍵酶——pGT 酶的序列比對(duì)以及進(jìn)化分析。 結(jié)果顯示，在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，嬰幼兒源長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢， 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期所能達(dá)到的活菌數(shù)也相對(duì)較低。 嬰幼兒源菌株多數(shù)可利用甘露糖， 而中年人和老年人來源的菌株多數(shù)不能利用甘露糖。除了3 株老年人源的菌株，其它菌株都可利用低聚果糖、 低聚半乳糖和低聚異麥芽糖。 嬰幼兒源菌株表面胞外多糖產(chǎn)量低于中年人和老年人來源的菌株， 與老年人源菌株具有顯著性差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，嬰幼兒源菌株的pGT 酶C 端氨基酸序列和老人源菌株的pGT酶C 端氨基酸序列呈現(xiàn)部分聚類的趨勢(shì)。