介怡琳 李曉云 紀(jì)勝男 趙前程 馬美湖 黃 茜

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 蛋品加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蛋品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢430070）

眾所周知，雞蛋營(yíng)養(yǎng)十分豐富，雞蛋中的蛋白質(zhì)更是種類繁多，功能各異，在雞胚胎發(fā)育中以及為人類提供營(yíng)養(yǎng)方面都扮演著不同的角色。 依據(jù)雞蛋蛋白質(zhì)特殊的功能可以開(kāi)發(fā)不同的功能食品。 雞蛋蛋黃中存有一種高磷酸化蛋白質(zhì)——卵黃高磷蛋白（PV），它是蛋黃中的主要磷蛋白，占蛋黃干物質(zhì)量的2%， 含磷9.7%， 占蛋黃總磷量的80%[1]。 由于卵生動(dòng)物的胚胎骨骼在礦化形成過(guò)程中所需的磷主要來(lái)自卵中含磷物質(zhì)， 因此不難推斷： 組成雞胚骨骼的重要礦物羥基磷灰石中的磷大部分由PV 提供，PV 在卵生動(dòng)物的骨礦化中起著重要作用。

生物礦化是指在生物體一些部位的特定環(huán)境中，通過(guò)細(xì)胞和有機(jī)基質(zhì)等的共同參與，環(huán)境中無(wú)機(jī)元素選擇性地在特定有機(jī)基質(zhì)上形核、生長(zhǎng)、相變，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒂^高度有序，宏觀形態(tài)功能各異的礦物的過(guò)程[2]。骨骼是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最常見(jiàn)的生物礦化組織。 骨組織的細(xì)胞間質(zhì)由有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)質(zhì)構(gòu)成，無(wú)機(jī)質(zhì)主要是鈣鹽，約占骨質(zhì)量的2/3，主要為羥基磷灰石結(jié)晶，呈細(xì)針狀，沿膠原纖維的長(zhǎng)軸排列。 由此可見(jiàn)，磷是骨組織的重要組成元素。近年來(lái)， 人們認(rèn)識(shí)到磷酸化蛋白質(zhì)（phosphoprotein）在仿生礦化過(guò)程中起到很重要的作用[3]。一些學(xué)者研究了骨橋蛋白、 牙本質(zhì)磷蛋白等磷蛋白調(diào)節(jié)生物礦化的過(guò)程， 有望為仿生材料的研究帶來(lái)突破[4-5]。

卵黃高磷蛋白（Phosvitin，PV）與骨礦化密切相關(guān)[6-8]。 大量的體外研究表明PV 具有調(diào)控礦化的作用。體外研究是基于將PV 吸附或共價(jià)結(jié)合到某種基質(zhì)上的模型開(kāi)展的。 Linde 等[9]將PV 共價(jià)交聯(lián)在瓊脂糖珠上，可以誘導(dǎo)礦化物的形成，而去磷酸化后的PV 誘導(dǎo)效果明顯減弱。李春艷[10]研究了PV 對(duì)雞胚胎骨骼發(fā)育的影響，結(jié)合體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)初探其機(jī)制。通過(guò)跟蹤分析孵化期間PV 磷酸根含量、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、雞胚腔骨ALP 活力、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率等指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)PV 通過(guò)脫磷酸化提供雞胚骨骼形成需要的磷。隨后，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立模型初探了PV 促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞礦化的可能機(jī)制，推測(cè)在誘導(dǎo)礦化的過(guò)程中PV 替代了VC 的作用， 作為強(qiáng)抗氧化劑/還原劑參與合成膠原，進(jìn)而促進(jìn)成骨過(guò)程。PV 通過(guò)上調(diào)I 型膠原蛋白Col-I mRNA 和骨鈣蛋白mRNA 的表達(dá)， 促使其下游產(chǎn)物ALP 表達(dá)水平增加， 進(jìn)而誘導(dǎo)礦化活動(dòng)增強(qiáng)。

然而，在骨構(gòu)建過(guò)程中，成骨細(xì)胞的骨形成及破骨細(xì)胞的骨吸收是維持骨重建過(guò)程動(dòng)態(tài)平衡的兩個(gè)階段，兩個(gè)過(guò)程存在著功能偶聯(lián)[11]。 這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)幾種信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)， 即RANK/RANKL/OPG，Smads 和 MAPK 途 徑。 RANK/RANKL/OPG 通路是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的經(jīng)典信號(hào)通路[12]。 這個(gè)信號(hào)通路中的主要信號(hào)分子包括核因子κB 受體活化因子（RANK），RANK配體（RANKL）和骨保護(hù)素OPG。 RANKL，OPG 主要由成骨細(xì)胞表達(dá)，破骨細(xì)胞分泌RANK，OPG 可與RANKL 結(jié)合，與RANK 有拮抗關(guān)系，即OPG/RANKL 的高比值意味著抑制RANK 與RANKL的結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化與成熟[13]。 破骨細(xì)胞主導(dǎo)骨吸收[14]，骨吸收超過(guò)骨形成會(huì)使骨重建出現(xiàn)負(fù)平衡，將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨骼疾病。多種因素可調(diào)控骨吸收[15]。 破骨細(xì)胞含有抗酒石酸酸性磷酸酶 （Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）等骨吸收過(guò)程的作用物質(zhì)[16]。RAW264.7 可在巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和RANKL 的刺激下中生長(zhǎng)[17]，表現(xiàn)出高水平的破骨細(xì)胞分化，是研究骨吸收的常用細(xì)胞[18-19]。

目前關(guān)于PV 對(duì)破骨細(xì)胞的影響研究較少[20-21]。本試驗(yàn)中探討不同濃度的PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。 另外，用RANKL 和MCSF[22-23]共同誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[24-25]，探究PV 對(duì)破骨細(xì)胞形成和TRAP 活性的影響。探明PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵黃高磷蛋白，參照Z(yǔ)hang 等[25]的方法從蛋黃中分離純化卵黃高磷蛋白，采用HPLC 或SDSPAGE 進(jìn)行純度鑒定（95%以上）；新鮮雞蛋（海蘭褐），武漢九峰山養(yǎng)雞場(chǎng)。

RAW264.7，上海中科院細(xì)胞庫(kù)；M-CSF（BR），美國(guó)PeproTech 公司；RANKL（BR），美 國(guó)PeproTech 公司；DMEM（BR），北京賽默飛世爾生化制品有限公司；胎牛血清（BR），澳洲GIBCO 公司；0.25%胰酶-EDTA （BR）， 美國(guó)HYCLONE 公司；鏈霉素-青霉素（BR），美國(guó)HYCLONE 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BR），碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（KGA108），南京凱基生物；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（KGA512），南京凱基生物；TRAP kit（BR），Sigma-aldrich；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 （HERAcell150I）， 德國(guó)Thermo Scientific 公司； 熒光倒置顯微鏡（IX71），日本Olympus 公司； 流式細(xì)胞儀（FACSCalibur），美國(guó)BD 公司。

1.3 溶液的配制

1）PBS 溶液 NaCl 8 g、Na2HPO4·12H2O 3.49 g、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g， 用超純水定容1 L，將pH 值調(diào)至7.2，用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，高壓滅菌后常溫保存。

2）無(wú)Ca2+、Mg2+Hanks 溶液 NaCl 8 g、KCl 0.4 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.3 5g、HEPES 4.76 g，用超純水定容1 L，調(diào)pH 值至7.4，用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，高壓滅菌后常溫保存。

3）細(xì)胞凍存液 按照VDMEM∶V胎牛血清∶VDMSO=6∶3∶1 配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4）完全培養(yǎng)基 89%的DMEM，10%的胎牛血清，1%的雙抗 （100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素），用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，于4 ℃儲(chǔ)存。

5）分化培養(yǎng)基 含有50 ng/mL 的M-CSF和50 ng/mL 的RANKL 的完全培養(yǎng)基。

6）細(xì)胞裂解液 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，添加0.1%的Tritonx-100。

1.4 方法

探究PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞生長(zhǎng)及分化功能的影響。單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)：不同濃度的PV。參考國(guó)內(nèi)外關(guān)于非膠原蛋白調(diào)控礦化的試驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)[3]，[26]，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究，蛋白質(zhì)量濃度選用100 μg/mL[10，26]。本試驗(yàn)以此為依據(jù)，設(shè)置0，50，100，200 μg/mL 和500 μg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度組， 測(cè)定不同濃度PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化的影響。

1.4.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)操作程序[27]

1.4.1.1 細(xì)胞凍存 培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%左右時(shí)消化細(xì)胞，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入凍存液吹打分散均勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度（細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）為5×106～1×107。 將細(xì)胞分裝至凍存管中，做好標(biāo)記。于-20 凍藏30 min，-80 ℃凍藏12 h，隨后保存于液氮中。

1.4.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中快速取出細(xì)胞凍存管， 立即置于37 ℃水浴鍋中連續(xù)晃動(dòng)快速解凍。凍存液移至離心管中，加入適量培養(yǎng)基，1 000 r/min 離心3 min，倒掉上層液體，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，緩慢吹打50 次，均勻接種至培養(yǎng)瓶。 做好標(biāo)記，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 換液，棄培養(yǎng)基，用Hanks 清洗細(xì)胞3 次，加入新鮮培養(yǎng)液。

1.4.1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞融合到70%～80% 時(shí)進(jìn)行傳代。 棄培養(yǎng)液，加入Hanks溶液緩慢清洗細(xì)胞3 次。 加入適量胰酶消化液消化細(xì)胞。 之后， 加入消化液體積2 倍的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散至均勻狀態(tài)。 將細(xì)胞移至離心管中，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液并吹打均勻，接種到培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 注意傳代比例為1∶4～1∶6。

1.4.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖 取RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基[25]， 將細(xì)胞置于37℃、5% CO2、濕度90%培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞做試驗(yàn)。

CCK-8 法檢測(cè)不同濃度的PV 對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響[28]。 取DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL的密度接種于96 孔板，每孔100 μL 細(xì)胞懸浮液。將96 孔板放入培養(yǎng)箱中2 h， 然后分別取不同質(zhì)量濃度的PV （0，50，100，200 μg/mL 和500 μg/mL）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，空白組不含細(xì)胞和PV。 將96 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48 h，更換含有10% CCK-8 的培養(yǎng)基， 于37°C 條件下反應(yīng)2 h， 置于酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)OD 值。 試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞增殖活力（%）=[（OD試驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組- OD空白組）]×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期 取RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置37°C、5% CO2、濕度90%培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。 采用流式法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的PV（0，50，100，200 μg/mL 和500 μg/mL）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞周期的影響。

取DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞， 以5×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為2.5 mL/孔。 取不同濃度PV的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將6 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48 h。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞用培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液， 按每孔5×105將細(xì)胞均勻接種到6孔板中， 在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過(guò)夜。 用PBS 消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min， 棄上清，PBS 重懸潤(rùn)洗2次。 1 000 r/min 離心5 min， 棄上清，100 μL PBS重懸細(xì)胞， 緩慢加入700 μL 預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終含量為70%。 4 ℃固定4 h 以上，1 000 r/min 離心5 min， 預(yù)冷PBS 潤(rùn)洗2 次。 入100 μL RNase（50 μg/mL），37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI（50 μg/mL），4 ℃避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.4 RAW264.7 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 取RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基， 將細(xì)胞置于37°C、5% CO2、濕度90%培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。 采用流式法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的PV （0，50，100，200 μg/mL 和500 μg/mL）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞凋亡的影響。

取DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞， 以5×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為2.5 mL/孔。 分別取不同濃度PV 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將6 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48 h。

用PBS 消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。 加PBS 重懸，用PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞2 次，1 500 r/min 離心5 min。 使用AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。 步驟 是： ①加 入500 μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer），重懸細(xì)胞；②5 μL AnnexinV-FITC（膜聯(lián)蛋白-V-熒光素）混勻后加入5 μL PI，混勻；③室溫避光反應(yīng)5～15 min [空白對(duì)照孔不做任何處理；陽(yáng)性對(duì)照1：只加5 μL AnnexinV（膜聯(lián)蛋白-V）單標(biāo)；陽(yáng)性對(duì)照2：只加5 μL PI 單標(biāo)]；④流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.4.5 PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響 RAW264.7 細(xì)胞接近融合后 （此時(shí)為破骨細(xì)胞形成第0 天），換含最終質(zhì)量濃度為50 ng/mL的M-CSF 和50 ng/mL RANKL 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3 d 換液。 將細(xì)胞分組： 對(duì)照組（不含M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)劑）、模型組（含M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)劑）、不同質(zhì)量濃度的PV 組（0，50，100，200 μg/mL 和500 μg/mL），共7 組，培養(yǎng)于24 孔板中。 培養(yǎng)第8 天，取出培養(yǎng)板，收集培養(yǎng)液，進(jìn)行TRAP染色試驗(yàn)[25]，步驟如下：①細(xì)胞固定后，洗滌3～5次，每次3～5 min；②取兩支試管，各加入0.5 mL快速石榴石型堿溶液 和0.5 mL 亞硝酸鹽溶液，輕輕上、下翻轉(zhuǎn)混勻30 s，靜置2 min；③用預(yù)先配制好的染色液于37 ℃避光孵育1 h， 染色液配制方法：DD H2O 45 mL， 氨偶氮卞1 mL 萘酚 0.5 mL，醋酸2 mL，酒石酸鹽1 mL，每加入一種物質(zhì)后充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；④用PBS 清洗至變藍(lán)，于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4.6 對(duì)破骨細(xì)胞TRAP 活性的影響 對(duì)破骨細(xì)胞分化布板及PV 干預(yù)。 8 d 后，棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 細(xì)胞裂解液（1%的Triton X-100），吹打細(xì)胞，收集上清，按TRAP 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)TRAP 的活性[29]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次， 數(shù)據(jù)以平均值±S.D表示。 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）， 采用鄧肯分析法進(jìn)行差異性分析，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8 法從細(xì)胞數(shù)量水平上探究0，50，100，200μg/mL 和500 μg/mL PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性的影響[30-31]。圖1A、1B 分別為作用24，48h 后細(xì)胞的增殖活力數(shù)據(jù)。

由圖1A 可知，不同濃度的PV 組增殖活力顯著高于空白組（P ＜0.05），其中50，100，200 μg/mL PV 分別高出對(duì)照組63%，76%，41%，3 組之間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。 500 μg/mL PV 組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。由圖1B 可知，50，100，200 μg/mL PV 增殖活力分別高出空白對(duì)照組57%，64%，40%，3 組之間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。 而500 μg/mL PV 組出現(xiàn)抑制效果，細(xì)胞活力低于對(duì)照組。

圖1 不同濃度PV 處理24h（A），48h（B）對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentration PV on RAW264.7 viability for 24h（A），48h（B）

2.2 PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞儀[32]從細(xì)胞周期水平上檢測(cè)0，50，100，200，500 μg/mL PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的增殖活力影響。

圖2，3 分別顯示RAW264.7 細(xì)胞各時(shí)期的分布狀態(tài)。 表1，2 列出Cotfit 軟件分析的各組細(xì)胞G1、S 及G2 期細(xì)胞數(shù)在細(xì)胞周期中所占比例。 不同濃度的PV 對(duì)細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，S 期細(xì)胞顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）：處理24h 后，100，200 μg/mL PV 效果最好， 分別高出對(duì)照組12%，11%；處理48 h 后，50，100，200，500 μg/mL PV 分別高出對(duì)照組22%，14%，14%，14%。

圖4， 以增殖指數(shù)PI 表示RAW264.7 增殖活力。 24 h 組PI 值明顯高于48 h 組， 這是由 于RAW264.7 細(xì)胞是接觸抑制性細(xì)胞。處理24 h 后，50，100，200，500 μg/mL PV 分別高出對(duì)照組7%，11%，9%，9%； 處理48 h 后，50，100，200，500 μg/mL PV 分別高出對(duì)照組22%，13%，13%，13%。

不同濃度的PV 對(duì)細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比低濃度PV 處理細(xì)胞后，S 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、增殖指數(shù)PI 增加值更多。 細(xì)胞周期水平上的增殖結(jié)果與CCK-8 結(jié)果趨向一致，說(shuō)明低濃度PV 促進(jìn)細(xì)胞增殖效果更好。

圖2 不同濃度PV 處理24 h 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig.2 Result of flow cytometry analysis for 24 h

表1 處理24 h 不同時(shí)期細(xì)胞百分含量Table 1 The percentage of cells in different periods for 24 h

表2 處理48 h 不同時(shí)期細(xì)胞百分含量Table 2 The percentage of cells in different periods for 48 h

圖3 不同濃度PV 處理48 h 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig.3 Result of flow cytometry analysis for 48 h

圖4 PV 處理24h（a），48h（b）對(duì)細(xì)胞周期的影響（細(xì)胞增殖指數(shù)）Fig.4 Effect of PV on RAW264.7 cell cycle for 24h（a），48h（b）RAW264.7 （cell proliferation index）

2.3 PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀[33]檢測(cè)0，50，100，200 μg/mL和500 μg/mL PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞凋亡的影響。圖5、6 分別為作用24 h 和48 h 后的結(jié)果。圖中左下代表正常細(xì)胞，右下代表凋亡早期的細(xì)胞，右上代表凋亡晚期的細(xì)胞，左上代表壞死的細(xì)胞[34]。

表3，4 顯示用流式細(xì)胞儀FCS Express 分析軟件處理后，得到的不同濃度PV 作用RAW264.7細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡率、 晚期細(xì)胞凋亡率及總凋亡率。 處理24 h 后，總、早期、晚期凋亡率分別低于對(duì)照組15%，10%，4%；處理48 h 后，總、早期、晚期凋亡率分別低于對(duì)照組9%，2%，7%； 而500 μg/mL PV 組凋亡率高于空白對(duì)照組。

2.4 PV 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響

通過(guò)TRAP 染色[35-36]觀測(cè)到RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的形態(tài)（圖7）。 如圖7b 所示，質(zhì)量濃度均為50 ng/mL 的RANKL 和M-CSF 成功促進(jìn)了破骨細(xì)胞的形成（TRAP 染色陽(yáng)性，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核多于3 個(gè)，胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒[37]）。 與圖7b 模型組相比，不同濃度的PV 均顯著減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，且與濃度呈正相關(guān)。200 μg/mL PV 的抑制效果最好。

圖5 PV 處理24h 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of PV on RAW264.7 cell apoptosis for 24 h

圖6 PV 處理48h 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of PV on RAW264.7 cell apoptosis for 48h

表3 PV 處理24 h 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Table 3 Effect of PV on RAW264.7 cell apoptosis for 24 h

表4 PV 處理48 h 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Table 4 Effect of PV on RAW264.7 cell apoptosis for 48 h

圖7 不同濃度PV 對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響Fig.7 Effect of PV on RAW264.7 -induced osteoclastogenesis

2.5 PV 對(duì)TRAP 活性的影響

TRAP 活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。 分化培養(yǎng)基模型組（2 組）的TRAP 活性顯著高于普通培養(yǎng)基對(duì)照組 （1 組）（P＜0.05）。 不同濃度 （50，100，200 μg/mL ）的PV 組與模型組相比，均可顯著降低TRAP的活性（P ＜0.05），且呈濃度依賴性。 50，100，200 μg/mL PV 分別低于模型組24%，41%，65%，其中，200 μg/mL PV 抑制作用最強(qiáng)（P＜0.05）。PV 通過(guò)顯著地降低TRAP 的活性， 抑制RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。

圖8 不同濃度PV 對(duì)TRAP 活性的影響Fig.8 Effect of PV on the TRAP activity

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：PV 不是通過(guò)抑制RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)，而是通過(guò)顯著地降低TRAP 的活性，進(jìn)而抑制RAW264.7 細(xì)胞分化成為破骨細(xì)胞。另外，有研究顯示， 雞蛋卵黃蛋白可顯著抑制骨造血細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化， 并且能夠抑制破骨細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)以及TRAP 活性， 進(jìn)而抑制其骨吸收活性[38-40]，而酪蛋白對(duì)照組沒(méi)有此作用[41]。

與PV 類似的非膠原蛋白質(zhì)骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）和骨唾液蛋白 （Bone Sialoprotein，BSP）也具有抑制破骨細(xì)胞分化的功能[42]。 另外，在骨吸收過(guò)程中，OPN 可以將破骨細(xì)胞錨定到骨上。相關(guān)的研究還有很多，可為PV 研究提供借鑒。 例如牛乳鐵蛋白（Bovine Lactoferrin， BLF）主要通過(guò)OPG/RANL/RANK 信號(hào)通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞的生成和骨吸收[43]， 且其抑制骨吸收的IC50為200 μg/mL。

RANK/RANKL、NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，以及c-fos 和NFATc1 與骨吸收都有密切關(guān)系。另外，TRAP、MMP-9、CTR、Cathepsin K，促炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 都可以作為骨吸收的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)于研究PV 的信號(hào)通路具有重要意義。 調(diào)控機(jī)制明確后，可開(kāi)發(fā)利用PV 作為骨骼健康的功效成分。

4 結(jié)論

研究了從雞蛋中提取的卵黃高磷蛋白對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的PV 對(duì)細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用。 與對(duì)照組相比，用低質(zhì)量濃度PV（50、100、200 μg/mL）處理細(xì)胞后，S 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、 增殖指數(shù)PI 增加值多。凋亡結(jié)果表明，50，100，200 μg/mL PV 組凋亡率都顯著低于空白對(duì)照組，500 μg/mL 組凋亡率高于空白組。 此外， 在TRAP 染色細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)及TRAP 活性方面，不同濃度的PV 均可顯著減少破骨細(xì)胞數(shù)量，降低TRAP 的活性（P＜0.05），且呈濃度依賴性，其中200 μg/mL 為最佳抑制質(zhì)量濃度?？傊琍V 通過(guò)降低TRAP 的活性， 達(dá)到抑制RAW264.7 細(xì)胞分化成為破骨細(xì)胞。 本研究結(jié)果對(duì)拓展雞蛋中卵黃高磷蛋白在促進(jìn)骨骼發(fā)育，抑制破骨細(xì)胞分化方面提供了試驗(yàn)依據(jù)。