黎小東, 梁景耀, 曹文苓, 畢超, 李平, 王建琴, 張錫寶

(廣州市皮膚病防治所,廣東 廣州 510095)

淋病是性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)中的乙類傳染病，全球建立了眾多監(jiān)測點，各點報道淋球菌對抗生素耐藥性日益趨重，對淋病造成巨大威脅[1-2]。監(jiān)測淋球菌對7種抗生素的耐藥情況及其產(chǎn)青霉素酶的淋球菌(penicillinase- producingNeisseriagonorrhoeae,PPNG)和質(zhì)粒介導(dǎo)的高度耐四環(huán)素淋球菌(tetracycline resistantNeisseriagonorrhoeae,TRNG)的流行情況，可為臨床治療淋病提供科學(xué)指導(dǎo)。本研究對本單位2019年STD門診患者分離培養(yǎng)出來的100株淋球菌進(jìn)行最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)及PPNG、TRNG測定，現(xiàn)將檢測結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 100株淋球菌取自2019年1—12月本單位STD患者的泌尿生殖道分泌物，其中來源于男性患者90株，女性患者10株；患者年齡17～73歲。所有菌株經(jīng)過革蘭染色、氧化酶試驗和糖發(fā)酵試驗驗證，傳代一次后洗于脫脂牛奶中，于-80 ℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 抗生素 青霉素(R082H0，USP)、四環(huán)素(R039W0，USP)、環(huán)丙沙星(10L049，USP)、大觀霉素(H0M399，USP)、頭孢曲松(R07420，USP)、頭孢克肟(R095XO，USP)、阿奇霉素(R043P0，USP)均由中國疾病預(yù)防中心性病控制中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(OXOID公司生產(chǎn)，LOT1784808)加入10% 脫纖維新鮮羊血。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株 世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)標(biāo)準(zhǔn)淋球菌菌株D、G、J、L、P由中國疾病預(yù)防中心性病控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 實驗菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株用T-M平板培養(yǎng)16～20 h的淋球菌菌苔[3]，用生理鹽水制成1×107CFU/mL菌懸液。

1.2.2 MIC測定 采用WHO西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法，先將7種抗菌藥物按要求配成原液，再倍比稀釋成不同的濃度，青霉素0.03～32 mg/L，環(huán)丙沙星0.008～32 mg/L，四環(huán)素8～16 mg/L，大觀霉素1～128 mg/L，頭孢曲松和頭孢克肟0.002～1 mg/L，阿奇霉素0.016～8 mg/L。將3.7%淋球菌基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌，水浴冷卻至50 ℃，加入脫纖維新鮮羊血(終濃度10%)。取0.2 mL倍比稀釋好的7種抗菌藥物工作液，加入20 mL淋球菌血液基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻后傾倒平板。從低濃度至高濃度配制各種濃度的平板。用多頭接種器將實驗菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液接種于各種濃度的平板，置36 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，記錄無菌落生長的MIC。以WHO的D、G、J、L、P標(biāo)準(zhǔn)菌株作質(zhì)控。

藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用WHO西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的標(biāo)準(zhǔn)[4]:青霉素和環(huán)丙沙星MIC≤0.03 mg/L為敏感，MIC 0.06～0.50 mg/L為低敏，MIC≥1 mg/L為耐藥；四環(huán)素MIC ≥16 mg/L為TRNG；頭孢曲松MIC≤0.06 mg/L為敏感，MIC≥0.125 mg/L為低敏；頭孢克肟MIC≤0.125 mg/L為敏感，MIC≥0.25 mg/L為低敏；大觀霉素MIC≤64 mg/L為敏感，MIC≥ 128 mg/L為耐藥；阿奇霉素MIC≤0.5 mg/L為敏感，MIC≥1 mg/L為耐藥。

1.2.3 β-內(nèi)酰胺酶測定 采用紙片碘量法測定菌株是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，具體操作如下：在試管中加入100 μL青霉素溶液(10 000 U/mL)、100 μL淀粉溶液(1%)、50 μL碘試劑，呈藍(lán)色混合物，在一濾紙條上滴50 μL試劑，將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在藍(lán)點上，放置1～2 min，如藍(lán)色變成無色即為β-內(nèi)酰胺酶陽性，顏色無變化則為陰性。每次試驗以WHO J株作陽性對照，D株作陰性對照。β-內(nèi)酰胺酶陽性為PPNG。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，PPNG和TRNG檢出率、各地同一藥物的耐藥率、低敏率等計數(shù)資料比較采用2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPNG和TRNG結(jié)果

100株淋球菌中檢出PPNG 35株， 陽性率為35%(35/100)；檢出TRNG 32株，陽性率為32%(32/100)。

2.2 MIC結(jié)果分布

100株淋球菌對大觀霉素均敏感，無耐藥株；環(huán)丙沙星耐藥株99株(99%)，無敏感株；青霉素耐藥株93株(93%)，敏感株2株(2%)；頭孢曲松敏感株78株(78%)，低敏株22株(22%)；頭孢克肟敏感株81株(81%)，低敏株19株(19%)；阿奇霉素敏感株90株(90%)，耐藥株10株(10%)；四環(huán)素MIC≥16 mg/L 32株,MIC≤8 mg/L 68株。詳見表1、表2。

表1 100株淋球菌MIC分布 株Tab.1 The MIC of 100 strains of Neisseria gonorrhoeae Strain

43株MIC≥16 mg/L的環(huán)丙沙星耐藥菌中：PPNG 11株、TRNG 13株；同時是PPNG和TRNG的三重耐藥菌5株，并阿奇霉素MIC≥8 mg/L的四重耐藥菌1株；并阿奇霉素MIC≥1 mg/L和并阿奇霉素MIC≥8 mg/L的雙重耐藥菌分別有7株和2株。4株MIC≥8 mg/L的阿奇霉素耐藥菌中，TRNG 3株。

表2 100株淋球菌抗菌活性檢測 株(%)Tab.2 Antibacterial activity of 100 strains of Neisseria gonorrhoeae Strains(%)

3 討論

淋病男女發(fā)病率差異較大[2]。本研究顯示2019年本單位STD門診的淋球菌株來源男女比例為9 ∶1，可能與女性癥狀不明顯及漏診等相關(guān)，建議STD門診患者，尤其是女性患者常規(guī)做淋球菌培養(yǎng)。

淋球菌耐藥性因時間和地區(qū)不同而有所差異[1,5]。本研究中，青霉素耐藥率93%，與本地區(qū)2008—2014年青霉素耐藥率(87%)[5]比較無明顯差異(2=2.84，P>0.05)，與浙江(90%)[6]、山東(96%)[7]接近，與江門(63%)[1]有明顯差異(2=33.0，P<0.05)。本研究中PPNG檢出率為35%，與2000—2005年P(guān)PNG(24%)[5]比較有差異 (2=6.18，P<0.05)，與2008—2014年P(guān)PNG (36%)[5]比較無明顯差異(2=0.08，P>0.05)，說明PPNG呈平緩階段。四環(huán)素耐藥率一直居高不下。本研究中TRNG(MIC≥16 mg/L)檢出率為32%，與2000—2005年TRNG(33%)[5]相比無明顯差異(2=0.08，P>0.05)，與2008—2014年TRNG(43%)[5]相比有差異(2=4.06，P<0.05)，TRNG呈下降趨勢。本年度PPNG、TRNG檢出率類似于東莞[8]，與廣西2013—2016年P(guān)PNG、TRNG的結(jié)果相似[9]，但與江門PPNG、TRNG的趨勢剛好相反[1]。青霉素與四環(huán)素已不作為治療淋病首選藥，但PPNG、TRNG仍是淋球菌耐藥性監(jiān)測的重要指標(biāo)。耐青霉素的菌株常對四環(huán)素和環(huán)丙沙星交叉耐藥，本實驗數(shù)據(jù)顯示，在43株環(huán)丙沙星高度耐藥(MIC ≥16 mg/L)株中，同時檢出PPNG菌株11株(11%)；TRNG菌株13株(13%)；與阿奇霉素(MIC≥1 mg/L)雙重耐藥菌株7株(7%)；同時檢出 PPNG、TRNG三重耐藥菌株5株(5%)，與本地區(qū)2007年(9.5%)[10]比較無明顯差異(2=1.32，P>0.05)。

本年度環(huán)丙沙星耐藥率(99%)與2008—2014年(98%)一致[5]，與浙江(100%)[6]、山東(96%)[7]接近，說明本地區(qū)環(huán)丙沙星耐藥率居高不下，且多重耐藥性，可能與環(huán)丙沙星屬氟喹諾酮類藥物，為泌尿感染的常用藥而使用廣泛有關(guān)，有待臨床篩查環(huán)丙沙星耐藥基因[11]和及時監(jiān)測有效藥物。

本年度阿奇霉素耐藥率(10%)與2016年阿奇霉素耐藥率(15%)[10]比較無明顯差異(2=1.1，P>0.05)，但高于山東[7]的報道。在4株阿奇霉素(MIC≥8 mg/L)耐藥菌株中，TRNG 3株(3%)；與環(huán)丙沙星(MIC≥16 mg/L)雙重耐藥菌株2株(2%)； 同時檢出PPNR、TRNG和環(huán)丙沙星四重耐藥菌株1株(1%)。阿奇霉素多重耐藥問題應(yīng)引起臨床重視。

頭孢曲松、頭孢克肟和大觀霉素都未見耐藥菌株，但頭孢曲松、頭孢克肟低敏率分別為22%、19%，與2016年的頭孢曲松、頭孢克肟低敏率(25%、33%)[12]比較無明顯差異(2值分別為0.39、5.29,P值均>0.05),呈持平趨勢。頭孢曲松低敏率(22%)遠(yuǎn)高于浙江(6%)[6]和山東(2%)[7]低敏率。國內(nèi)也可見頭孢曲松耐藥的報導(dǎo)[13]，可能與地區(qū)和/或標(biāo)本來源不同有關(guān)，也可能與各地區(qū)的性活動、性行為和藥物選擇、治療習(xí)慣(如伴侶沒有同時治療等)不同有關(guān)。

綜上所述，本研究顯示，大觀霉素抗菌活性最強(qiáng)，頭孢曲松、頭孢克肟未見耐藥株，可推薦為廣州地區(qū)治療淋病的首選藥物,但需長期監(jiān)測其淋球菌耐藥性；阿奇霉素多重耐藥株出現(xiàn)，不再單一用藥，建議聯(lián)合頭孢曲松用藥；青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星已不再是淋病治療主要藥物[8-10]，但需關(guān)注其導(dǎo)致淋球菌耐藥性傳播問題和聯(lián)合用藥導(dǎo)致選擇性耐藥產(chǎn)生的問題。