梁鑫，張仁懷，呂自力，艾華偉，劉冬，梁波，單旭東，陳浩然

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都，610041)2(四川省人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，四川 成都，610041)3(成都遠(yuǎn)睿生物技術(shù)有限公司，四川 成都，610000)4(河南多美康生物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州，450000)

膠原蛋白是脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛分布于動(dòng)物結(jié)締組織、韌帶、跟腱等，約占生物體自身總蛋白含量的30%，皮膚干重的3/4[1]。同時(shí)，參與細(xì)胞的增殖、分化與遷移，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定機(jī)械強(qiáng)度[2]。因具有其他合成材料無(wú)法比擬的生物相容性、可生物降解性以及可大規(guī)模生產(chǎn)的可行性等優(yōu)點(diǎn)，膠原蛋白廣泛應(yīng)用于健康食品、化妝品、生物材料和醫(yī)藥工業(yè)[3-5]。

目前，膠原蛋白的生產(chǎn)方法主要有：傳統(tǒng)提取法、化學(xué)合成法、現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)法[6-7]。傳統(tǒng)提取法和化學(xué)合成法所獲得的膠原蛋白活性較低，且?guī)в邪踩[患[8-9]。與動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白相比，重組膠原蛋白具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性、安全性、親水性、可加工性和低免疫原性的特點(diǎn)[10-13]。已有多種通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人源性膠原蛋白的研究，涉及大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因作物、轉(zhuǎn)基因小鼠等不同表達(dá)體系。因哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因小鼠等表達(dá)體系成本高、周期長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)化需求，相比之下酵母和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、速度快、技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、可進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)化生產(chǎn)的首選方式。

本研究利用酵母分泌表達(dá)獲得重組人Ⅲ型膠原蛋白發(fā)酵液，以鹽析沉淀和陽(yáng)離子柱層析結(jié)合的方法，純化出高純度的重組人Ⅲ型膠原蛋白。該純化工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，為其后續(xù)開(kāi)發(fā)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組人Ⅲ型膠原蛋白發(fā)酵液，由本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)；XK 16/20層析柱、Capto SP impress(Capto SP)、SP Sepharose High Performance(強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱, SP HP)填料，GE healthcare公司；Cellufine MAX S-h(MAX S-h)、JNC corporation、SP Beads 6 FF，常州天地人和；重組人Ⅲ型膠原蛋白兔多抗，武漢博士德生物工程有限公司；驢抗兔HRP標(biāo)記二抗，北京博奧森公司；其余化學(xué)試劑，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA pure System層析系統(tǒng)，GE healthcare公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司；電泳儀，BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重組人Ⅲ型膠原蛋白發(fā)酵液鹽析

取離心過(guò)濾后發(fā)酵液，緩慢加入飽和硫酸銨，使其硫酸銨飽和度分別為15%、20%、30%。于室溫下放置10 min，5 000 r/min離心3min，分別收集上清液及沉淀，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)。

1.3.2 重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析緩沖條件篩選

配制pH為5.5的20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH為6.0和6.5的20 mmol/L磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)，pH為8.0的20 mmol/L Tris緩沖液，分別以SP Beads 6F填料進(jìn)行層析純化。收集各步驟樣品，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.3 重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析填料篩選

以20 mmol/L PB(pH 6.0)緩沖液，分別用Capto SP impress、MAX S-h、SP Beads 6FF、SP HP填料進(jìn)行柱層析。收集各步驟樣品，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.4 重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析洗脫條件摸索及驗(yàn)證

以20 mmol/L PB(pH 6.0)平衡陽(yáng)離子交換層析柱，上樣再平衡后，以NaCl濃度梯度進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。確定最佳洗脫條件后，以該條件進(jìn)行至少2次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組人Ⅲ型膠原蛋白硫酸銨鹽析結(jié)果

為降低層析上樣時(shí)間，采用鹽析法沉降重組人Ⅲ型膠原蛋白，再以超純水復(fù)溶，從而起到濃縮的作用，并對(duì)樣品進(jìn)行初步純化。如圖1所示，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到20%時(shí)，發(fā)酵液開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，但沉淀不完全；當(dāng)飽和度達(dá)到30%時(shí)，上清中重組人Ⅲ型膠原蛋白幾乎完全沉淀。因此，后續(xù)純化對(duì)樣品的初處理采用30%飽和度的硫酸銨以沉淀并濃縮重組人Ⅲ型膠原蛋白。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-發(fā)酵液上清；2-15%飽和度硫酸銨鹽析上清；3、 4-20%飽和度硫酸銨鹽析上清；5、 6-30%飽和度硫酸銨鹽析上清圖1 重組人Ⅲ型膠原蛋白硫酸銨鹽析電泳圖

2.2 pH對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析的影響

利用不同的緩沖體系，對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白在pH為5.5、6.0、6.5、8.0時(shí)進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析的捕獲情況進(jìn)行研究。層析填料：MAX SH;樣品：發(fā)酵液以30%飽和度硫酸銨鹽析，沉淀用超純水復(fù)溶后，對(duì)相應(yīng)pH緩沖液透析;洗脫條件：0～1 mol/L NaCl線(xiàn)性梯度洗脫，出峰后分步收集。層析結(jié)果如圖2所示，在堿性條件下，重組人Ⅲ型膠原蛋白未被捕獲，而在酸性條件時(shí)，可被陽(yáng)離子交換柱捕獲。其中，pH為6.0時(shí)，流穿中重組人Ⅲ型膠原蛋白量最少，重組人Ⅲ型膠原蛋白損失最小。因此，選用pH 6.0的緩沖條件進(jìn)行重組人Ⅲ型膠原蛋白的純化。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-上樣前樣品；2-層析穿透；3～13-分步收集樣品A-pH 5.5檸檬酸鹽緩沖液陽(yáng)離子柱層析結(jié)果；B-pH 6.0磷酸鹽緩沖液陽(yáng)離子柱層析結(jié)果；C-pH 6.5磷酸鹽緩沖液陽(yáng)離子柱層析結(jié)果；D-pH 8.0 Trise緩沖液陽(yáng)離子柱層析結(jié)果;圖2 pH對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析的影響

2.3 陽(yáng)離子交換層析填料的篩選

在研究了重組人Ⅲ型膠原蛋白最適捕獲緩沖體系后，在該體系下進(jìn)行適宜的陽(yáng)離子交換填料的篩選。結(jié)果如圖3所示，在pH 6.0的緩沖體系中，重組人Ⅲ型膠原蛋白與4種陽(yáng)離子交換填料都能結(jié)合。其中MAX S-h和SP HP填料的分辨率高，對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白的分離效果好，但是MAX S-h載量低，因此采用SP HP填料進(jìn)行后續(xù)研究。

M-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-上樣前樣品；2-層析穿透；3～16-分步收集樣品A-重組人Ⅲ型膠原蛋白MAX S-h柱純化結(jié)果；B-重組人Ⅲ型膠原蛋白SP beads 6FF柱純化結(jié)果；C-重組人Ⅲ型膠原蛋白Capto SP柱純化結(jié)果；D-重組人Ⅲ型膠原蛋白SP HP柱純化結(jié)果圖3 不同陽(yáng)離子交換層析填料對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白的分離

2.4 重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析洗脫條件優(yōu)化

在pH為6.0緩沖條件下，以SP HP陽(yáng)離子交換層析對(duì)重組人Ⅲ型膠原蛋白進(jìn)行純化，并對(duì)洗脫條件進(jìn)行研究。上樣后，以0～1 mol/L NaCl線(xiàn)性梯度洗脫。結(jié)果如圖4所示，分析純化圖譜A和電泳圖B、C，洗脫峰p1、p3、p4的NaCl濃度分別為52、150、250 mmol/L。250 mmol/L NaCl洗脫的p4，為高純度重組人Ⅲ型膠原蛋白。

A-重組人Ⅲ型膠原蛋白SP HP純化層析圖；B、 C-重組人Ⅲ型膠原蛋白SP HP純化電泳圖圖4 SP HP陽(yáng)離子交換層析柱線(xiàn)性梯度洗脫結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，采用52、150、250 mmol/L NaCl進(jìn)行階段梯度洗脫，結(jié)果如圖5所示，重組人Ⅲ型膠原蛋白在250 mmol/L NaCl條件下被洗脫下來(lái)，而52、150 mmol/L NaCl洗脫品為重組人Ⅲ型膠原蛋白的降解物。

M-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-上樣前樣品；2-層析穿透；3、 4-52 mmol/L NaCl洗脫樣；5-150 mmol/L NaCl洗脫樣；6-250 mmol/L NaCl 洗脫樣；7-1 mol/L NaCl清洗層析柱圖5 重組人Ⅲ型膠原蛋白陽(yáng)離子交換層析階段梯度洗脫結(jié)果

采用優(yōu)化后的層析工藝對(duì)60 L發(fā)酵液進(jìn)行重組人Ⅲ型膠原蛋白的純化，產(chǎn)品純度97.7%，總回收率68.8%，如表1所示。

表1 重組人Ⅲ型膠原蛋白純化工藝各步驟回收率

2.5 重組人Ⅲ型膠原蛋白的鑒定

將純化的蛋白采用免疫印跡進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，方法參見(jiàn)《中國(guó)藥典》[14]，證明其為重組人Ⅲ型膠原蛋白，結(jié)果如圖6所示。

M-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-重組人Ⅲ型膠原蛋白考馬斯亮藍(lán)染色；2-重組人Ⅲ型膠原蛋白免疫印跡圖6 重組人Ⅲ型膠原蛋白免疫印跡檢測(cè)及考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)照

2.6 重組人Ⅲ型膠原蛋白的純度分析

采用分子排阻高效液相色譜(size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC)對(duì)純化的重組人Ⅲ型膠原蛋白進(jìn)行純度分析，其純度為97.7%，結(jié)果如圖7所示。

圖7 重組人Ⅲ型膠原蛋白SEC-HPLC分析

3 討論與結(jié)論

重組人Ⅲ型膠原蛋白在醫(yī)藥、保健、營(yíng)養(yǎng)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)其開(kāi)發(fā)生產(chǎn)具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值。早期的重組膠原蛋白，多采用大腸桿菌表達(dá)，分離純化工藝復(fù)雜，熱原難以控制。王曉軍等[15]從大腸桿菌中經(jīng)陰離子交換和分子篩(Sephadex G-100)柱層析分離重組膠原蛋白，最終產(chǎn)物純度達(dá)98%，回收率為80.5%。畢赤酵母由于既有原核微生物的特點(diǎn)，又有真核生物的特性，可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾，近年來(lái)在膠原蛋白的表達(dá)中越來(lái)越受到青睞。周愛(ài)梅等[10]采用巴氏畢赤酵母分泌表達(dá)重組人源膠原蛋白，采用40%飽和度硫酸銨沉淀和Sephadex G-100純化得到電泳重組人源膠原蛋白。但上述工藝中，由于分子篩柱層析費(fèi)時(shí)少、處理量小，不利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

本研究建立了一步層析法從畢赤酵母發(fā)酵液中純化重組人Ⅲ型膠原蛋白：發(fā)酵液以30%飽和度硫酸銨鹽析沉淀重組人Ⅲ型膠原蛋白，沉淀用超純水復(fù)溶后，對(duì)20 mmol/L PB(pH 6.0)超濾、轉(zhuǎn)換介質(zhì)，上陽(yáng)離子交換柱SP HP，以20 mmol/L PB(pH 6.0)-150 mmol/L NaCl洗脫雜蛋白及降解的重組人Ⅲ型膠原蛋白，以20 mmol/L PB(pH 6.0)-250 mmol/L NaCl洗脫重組人Ⅲ型膠原蛋白。該純化工藝簡(jiǎn)便，離子交

換層析放大容易，因此更便于產(chǎn)業(yè)化。純化的高純度、全分子重組人Ⅲ型膠原蛋白，熱原含量低，可用于醫(yī)藥領(lǐng)域，如醫(yī)用海綿、薄膜、縫合線(xiàn)等。