劉晨 陶樂婷

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均居第2位。近年來，胃癌發(fā)病率逐漸上升，且呈年輕化趨勢。若早期胃癌患者進(jìn)行根治手術(shù)，其術(shù)后5年生存率可達(dá)90%，然而由于早期胃癌缺乏特異性征象，檢出率較低，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期[1-2]。盡管新輔助化療、放療在一定程度上改善了治療效果，仍不可避免的出現(xiàn)化療耐藥和放療抗性，并存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險[3-4]。因此，尋找新的有效的治療方法是胃癌臨床亟待解決的重大問題。近年研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）的異常表達(dá)參與胃癌的分子調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 序列相似性家族201-成員A（family with sequence similarity 201-member A，F(xiàn)AM201A）在耐輻射食管鱗癌、肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)AM201A表達(dá)增加與食管鱗癌、肺癌的抗輻射性和低存活率密切相關(guān)，且敲除FAM201A 后食管鱗癌、肺癌的放射敏感性增強(qiáng)[5-6]。但目前鮮見FAM201A 與胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為以及放射敏感性的相關(guān)研究。miR-488-3p是一個腫瘤抑制因子，過表達(dá)miR-488-3p可提高黑色素瘤細(xì)胞的順鉑敏感性[7]。在胃癌中miR-488表達(dá)下調(diào)，并發(fā)揮抑癌基因作用[8]。FAM201A和miR-488-3p之間存在潛在靶向關(guān)系，但FAM201A能否調(diào)控miR-488表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和放射敏感性尚不明確。本研究旨在探討lncRNA FAM201A靶向miR-488-3p對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為及放射敏感性的影響和機(jī)制，以期為胃癌的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取2014年1月至2017年1月間于萊陽中心醫(yī)院確診并進(jìn)行胃癌根治性切除手術(shù)（術(shù)前均未經(jīng)過放療和化療治療）的胃癌患者的腫瘤組織標(biāo)本和配對的非癌性黏膜標(biāo)本63例，其中男性36例，女性27例。所有患者均知情同意。

人胃癌細(xì)胞MGC803 購自中科院上海細(xì)胞庫。LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen公司。si-FAM201A、pcDNA3.1、pcDNA3.1-FAM201A、miR-NC、miR-488-3p、si-con、anti-miR-488-3p、anti-miR-NC以及WT-FAM201A和MUT-FAM201A購自上海吉瑪公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素（annexin V fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）凋亡試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國Corning公司。Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天公司。兔源CyclinD1 抗體、兔源P21 抗體、兔源MMP-2抗體、兔源Bcl-2抗體、兔源Bax多抗體均購自美國Abcam公司。鼠源E-cadherin抗體購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠Ⅱ抗購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)MGC803細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期的MGC803細(xì)胞，按照每孔2×105個細(xì)胞密度接種于6孔板，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法利用LipofectamineTM2000將si-con、si-FAM201A轉(zhuǎn)染至細(xì)胞密度為60%的MGC803細(xì)胞，依次記為si-con組和si-FAM201A組，轉(zhuǎn)染24～72 h后，檢測轉(zhuǎn)染效果，隨后進(jìn)行后續(xù)研究。為進(jìn)一步證實(shí)FAM201A是通過調(diào)控miR-488-3p表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及放射敏感性，將si-FAM201A 與anti-miR-NC 或者antimiR-488-3p 同時轉(zhuǎn)染至MGC803 細(xì)胞，依次記為si-FAM201A+anti-miR-NC組、si-FAM201A+anti-miR-488-3p組，檢測抑制胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和放射敏感性變化。

1.2.2 qRT-PCR檢測 取0.5 cm3的切除組織磨碎，利用TRIzol試劑提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。FAM201A和miR-488-3p的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算（分別以GAPDH和U6為內(nèi)參）。FAM201A定量PCR引物序列如下（5'-3'）：FAM201A-F：TCTCTGATGGGAGCCTCTT TA；FAM201A-R：CAAGCCACAGACGGAGAAA；GAPD H-F：GGTGAAGGTCGGAGTCAACG；GAPDH-R：CCAT GTAGTTGAGGTCAATGAAG。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測 利用Starbase 2.0在線預(yù)測FAM201A的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-488-3p 與FAM201A-3'UTR 存在部分連續(xù)互補(bǔ)堿基對，推測miR-488-3p是FAM201A的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因檢測進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型WTFAM201A和突變型MUT-FAM201A的FAM201A-3'UTR 熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000 將miR-488-3p mimics和miR-NC 分別與WTRAP2B和MUT-RAP2B 共轉(zhuǎn)染MGC803 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒對各組MGC803細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行測定。

1.2.4 MTT 法檢測細(xì)胞活力 將MGC803 細(xì)胞按照每孔2×103個細(xì)胞密度接種于96 孔板，按照“1.2.1 分組”進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 時間點(diǎn)向各孔內(nèi)加入20 μL的MTT試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去上清后，再向各孔內(nèi)加入150 μL的DMSO，繼續(xù)孵育2 h，待結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm 波長處各孔的吸光度值。

1.2.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 侵襲實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48 h，用胰酶消化細(xì)胞后離心收集細(xì)胞，用適量的DMEM培養(yǎng)基（不含血清）重懸細(xì)胞。向Transwell下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，向已包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室內(nèi)加入300 μL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，擦去上室膜未穿膜的細(xì)胞，甲醇固定下室膜30 min，經(jīng)0.1%的結(jié)晶紫溶液染色20 min后，用PBS洗去多余染液，倒置于顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜情況，拍照，記錄5個視野細(xì)胞數(shù)目，取均值為侵襲細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)采用未包被Matrigel基質(zhì)膠的小室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 常規(guī)消化各組MGC803 細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液（濃度為1×106個/mL），利用Annexin V-FITC 凋亡試劑盒進(jìn)行染色，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot 檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞，常規(guī)提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測各組蛋白樣品濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維（nitrocellulose，NC）膜，5%脫脂牛奶室溫側(cè)擺搖床封閉30 min，洗膜后，依次加入Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育，參考ECL 試劑盒使用說明進(jìn)行發(fā)光顯色，采用GraphPad Prism 7 分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù) 按不同照射劑量，接種細(xì)胞于6 孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分別采用0、2、4、6、8 Gy的X線照射（照射時培養(yǎng)皿覆蓋2 cm厚有機(jī)玻璃板，源皮距為100 cm，劑量率為3.2 Gy/min），繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見集落，甲醇固定30 min，PBS 洗滌，0.1%的結(jié)晶紫染液染色20 min。顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞個數(shù)大于50的集落。計算各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，Graph Pad Prime 7軟件擬合多靶單擊模型計算相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量資料均采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM201A、miR-488-3p在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

與癌旁組織比較，胃癌組織中FAM201A的表達(dá)水平（1.04±0.10vs.0.29±0.03）顯著升高，miR-488-3p的表達(dá)（0.21±0.02vs.0.96±0.09）水平顯著降低（P＜0.05）。

2.2 抑制FAM201A 對細(xì)胞MGC803 增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

與si-NC組比較，si-FAM201A 組MGC803 細(xì)胞FAM201A的表達(dá)水平顯著降低，表明已成功構(gòu)建抑制FAM201A表達(dá)的MGC803 細(xì)胞株。與si-NC組比較，si-FAM201A 組MGC803 細(xì)胞Cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21、E-cadherin和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖1，表1、2。

圖1 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

表1 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖的影響 （±s，n=9）

表1 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖的影響 （±s，n=9）

與si-NC組比較，*P＜0.05

分組si-NC si-FAM201A FAM201A 1.03±0.10 0.42±0.04*CyclinD1 0.77±0.08 0.20±0.02*P21 0.31±0.03 0.97±0.10*細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.57±0.05 0.24±0.02*48 h 0.96±0.10 0.38±0.04*72 h 1.44±0.15 0.54±0.05*

表2 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803凋亡、遷移、侵襲的影響 （±s，n=9）

表2 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803凋亡、遷移、侵襲的影響 （±s，n=9）

與si-NC組比較，*P＜0.05

分組si-NC si-FAM201A MMP-2 0.73±0.07 0.14±0.01*E-cadherin 0.26±0.02 0.79±0.08*Bax 0.18±0.02 0.85±0.08*Bcl-2 0.88±0.09 0.27±0.03*遷移細(xì)胞數(shù)（個）134±13.78 66±6.82*侵襲細(xì)胞數(shù)（個）124±13.21 59±6.12*凋亡率（%）7.28±0.79 23.57±2.44*

2.3 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803放射敏感性的影響

采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）射線分別照射si-NC組和si-FAM201A組MGC803細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，并呈劑量依賴性，且si-FAM201A 組細(xì)胞存活率顯著低于si-NC組（P＜0.05，圖2）。單擊多靶模型參數(shù)見表3，提示抑制FAM201A表達(dá)可增加MGC803細(xì)胞放射敏感性。

圖2 抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803放射敏感性的影響

表3 抑制FAM201A表達(dá)后單擊多靶模型參數(shù)

2.4 FAM201A靶向、調(diào)控miR-488-3p的表達(dá)

利用StarBase v2.0 預(yù)測FAM201A靶基因，提示FAM201A 與miR-488-3p 具有部分連續(xù)結(jié)合的核苷酸（圖3）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與miRNC和WT-FAM201A 共轉(zhuǎn)染組比較，miR-488-3p和WT-FAM201A 共轉(zhuǎn)染組MGC803 細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC和MUT-FAM201A共轉(zhuǎn)染組比較，miR-488-3p和MUT-FAM201A 共轉(zhuǎn)染組MGC803 細(xì)胞的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。RT-qPCR 檢測顯示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-FAM201A 組MGC803 細(xì)胞miR-488-3p的表達(dá)水平顯著降低；與si-NC組比較，si-FAM201A 組MGC803 細(xì)胞miR-488-3p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 FAM201A靶向miR-488-3p

2.5 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖、凋亡、遷移、侵襲作用

與si-FAM201A+anti-miR-NC組比較，si-FAM201A+anti-miR-488-3p組MGC803 細(xì)胞Cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，miR-488-3p、P21、E-cadherin和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖4，表4、5。

圖4 抑制miR-488-3p 能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A 對細(xì)胞MGC803 增殖、遷移、侵襲、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖的影響 （±s，n=9）

表4 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803增殖的影響 （±s，n=9）

與si-FAM201A+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05

分組si-FAM201A+anti-miR-NC si-FAM201A+anti-miR-488-3p miR-488-3p 0.58±0.06 0.28±0.03#CyclinD1 0.21±0.02 0.65±0.06#P21 0.99±0.10 0.42±0.04#細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.23±0.02 0.46±0.04#48 h 0.36±0.04 0.75±0.07#72 h 0.55±0.05 1.06±0.10#

表5 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803凋亡、遷移、侵襲的影響 （±s，n=9）

表5 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803凋亡、遷移、侵襲的影響 （±s，n=9）

與si-FAM201A+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05

分組si-FAM201A+anti-miR-NC si-FAM201A+anti-miR-488-3p MMP-2 0.13±0.01 0.66±0.06#E-cadherin 0.81±0.08 0.35±0.03#Bax 0.86±0.08 0.24±0.02#Bcl-2 0.25±0.02 0.71±0.07#遷移細(xì)胞數(shù)（個）64±6.57 103±10.4#侵襲細(xì)胞數(shù)（個）60±6.23 95±9.61#凋亡率（%）23.81±2.67 9.92±1.04#

2.6 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803放射敏感性的作用

采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）射線照射各組MGC803細(xì)胞后，各組細(xì)胞存活率呈劑量依賴性顯著降低（圖5）。與si-FAM201A+anti-miR-NC組比較，si-FAM201A+anti-miR-488-3p組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）。單擊多靶模型參數(shù)見表6，提示抑制miR-488-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A 對細(xì)胞MGC803放射敏感性的影響。

圖5 抑制miR-488-3p能逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A對細(xì)胞MGC803放射敏感性的影響

表6 抑制miR-488-3p表達(dá)后單擊多靶模型參數(shù)

3 討論

長期以來，胃癌一直是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。放療和化療作為胃癌術(shù)后輔助治療手段在一定程度上改善了治療效果，但晚期胃癌患者的死亡率依然較高。為改善胃癌治療現(xiàn)狀，需要進(jìn)一步研究新的治療策略和靶點(diǎn)。

近期多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用。lncRNA MEG3在胃癌組織中表達(dá)顯著降低，MEG3的表達(dá)與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，與患者的生存時間呈正相關(guān)，過表達(dá)MEG3 在體外可降低胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[9]；lncRNA SNHG7通過調(diào)控p15和p16的表達(dá)，在一定程度上促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[10]；LncRNA DANCR 通過抑制胃癌細(xì)胞中的腫瘤低表達(dá)長鏈非編碼RNA（lncRNALET）而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[11]。FAM201A 位于人染色體9p13.1，全長2.9 Kbp。2015年，Yu 等[12]首次在人類強(qiáng)迫癥和妥瑞氏綜合征中對FAM201A進(jìn)行報道。近期Huang等[13]發(fā)現(xiàn)FAM201A與股骨頭壞死的發(fā)生有關(guān)。然而，關(guān)于FAM201A 與惡性腫瘤的報道較少。Matsumura 等[14]在分析結(jié)腸癌組織基因表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)FAM201A表達(dá)上調(diào)；Chen 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM201A 在耐輻射食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)AM201A通過發(fā)揮miR-101分子海綿作用上調(diào)突變蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）表達(dá)進(jìn)而調(diào)控食管癌細(xì)胞的放射敏感性；此外，F(xiàn)AM201A 在耐放療的非小細(xì)胞肺癌組織中也呈高表達(dá)，敲減FAM201A 通過靶向miR-370 抑制表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）和缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）表達(dá)增加非小細(xì)胞肺癌的放射敏感性[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM201A 在胃癌組織中呈高表達(dá)。隨后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FAM201A 功能，結(jié)果表明抑制FAM201A表達(dá)降低胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。此外，抑制FAM201A表達(dá)后胃癌細(xì)胞的耐輻射差異表明，抑制FAM201A表達(dá)可增加胃癌細(xì)胞的放射敏感性。這與FAM201A在食管癌和非小細(xì)胞肺癌中的作用一致。

近年來，隨著競爭性內(nèi)源RNA 假說的提出，lncRNA 發(fā)揮miRNA 分子海綿作用調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要作用被廣泛報道。為探索FAM201A調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和放射敏感性的分子機(jī)制，利用Starbase v2.0在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-488-3p和FAM201A存在互補(bǔ)堿基對。miR-488-3p 已被報道在食管鱗癌[15]、膠質(zhì)瘤[16]、肝癌[17]等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，此外，miR-488 還可通過激活真核翻譯起始因子3a（eukaryotic translation initiation factor 3a，eif3a）介導(dǎo)的核苷酸剪切修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）信號通路，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，降低其順鉑敏感性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-488在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，這與Zhao等[8]的研究結(jié)論一致。熒光素酶報告基因檢測和qPCR顯示，F(xiàn)AM201A可靶向負(fù)性調(diào)控miR-488的表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)FAM201A是通過調(diào)控miR-488-3p表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和放射敏感性，將si-FAM201A和antimiR-488-3p 同時轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制miR-488-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制FAM201A 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和放射敏感性的影響。

綜上所述，F(xiàn)AM201A 在胃癌組織中呈高表達(dá)，miR-488-3p 呈低表達(dá)，抑制lncRNA FAM201A 通過靶向miR-488-3p降低了胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并增加其放射敏感性。FAM201A有望成為胃癌臨床治療的新型分析靶點(diǎn)。