朱貝 郭小朋 董天祺 肖春杰

在過去30年間，中國肺癌相關(guān)死亡上升了4倍以上[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌相關(guān)死亡約80%[2]。NSCLC的發(fā)生和發(fā)展通常與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。因此，尋找NSCLC 新的分子生物學(xué)標(biāo)志物并將其作為NSCLC診斷及治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

MEX3A蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，其N端具有高度保守的KH結(jié)構(gòu)域[3-4]，MEX3A通過KH結(jié)構(gòu)域與mRNA，介導(dǎo)mRNA的翻譯、監(jiān)控和降解過程[5]，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的一系列功能。已有研究表明，MEX3A在膀胱癌、胃癌[6]、腎母細(xì)胞瘤[7]、膀胱尿路上皮癌[8]以及肝癌[9]中異常表達(dá)，但MEX3A 在NSCLC中的作用及功能卻鮮有研究。據(jù)此，本文探究了MEX3A 在NSCLC 中的表達(dá)效果以及沉默MEX3A基因后對NSCLC發(fā)生和發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)錄組芯片分析及TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析 利用轉(zhuǎn)錄組芯片分析技術(shù)，對云南省腫瘤醫(yī)院收集的15例宣威地區(qū)的肺癌樣本（癌和癌旁組織）進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組芯片分析，通過芯片制備、雜交反應(yīng)、信號檢測、數(shù)據(jù)分析，篩選出差異基因。對來自癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中共226例肺腺癌樣本與20例正常組織樣本進(jìn)行RNA序列分析。

1.1.2 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) 人NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H292 及人正常的肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B 均購自昆明動物研究所細(xì)胞中心，XWLC和GLC均受贈于云南省腫瘤醫(yī)院。A549、NCI-H292和BEAS-2B細(xì)胞均在RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）中培養(yǎng)，XWLC和GLC 在DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）中培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清（Hyclone，美國）、100 g/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素（Hyclone，美國）。所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取MEX3A 高表達(dá)的A549和NCI-H292細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞以5×104/孔接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，更換為不含抗生素的培養(yǎng)基，用脂質(zhì)體RNAiMAX（Invitrogen，美國）將MEX3A的靶向抑制劑小干擾RNA（siMEX3A：5'-GCAAGAUCCUCGAGUACAATT-3'，上海吉瑪公司）和陰性對照siRNA（siNC：5'-UUCUCUCUC CGAACGUGUCUCUCUGACGUTU TT-3'，上海吉瑪公司）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h以待分析。

1.2.2 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 根據(jù)試劑盒說明，提取細(xì)胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA（PrimeScriptTMRT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara，中國）。人GAPDH 用作內(nèi)參基因，qRT-PCR 監(jiān)測MEX3A 在BEAS-2B、NCI-H292、A549、XWLC和GLC 細(xì)胞中的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將3 000/孔細(xì)胞懸液接種在96孔板（Corning Costar，美國）中，設(shè)置3個復(fù)孔，分別在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后中加入10 μL CCK8試劑（Dojindo Laboratories，Kumamoto，日本），加入CCK8試劑2.5 h后，3 h內(nèi)每隔30 min用多功能酶標(biāo)儀測量細(xì)胞OD 450 nm處的吸光度。

1.2.4 Transwell 試驗(yàn) 在Transwell小室（Corning Costar，美國）中鋪好10 μL的基質(zhì)膠（25 mg/50 mL，BD Biosciences，美國），在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h，然后以30 000/孔將細(xì)胞接種到Transwell小室的上室中，下室用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)物，37℃培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)基并用4%多聚甲醛（生工生物工程有限公司，上海）固定細(xì)胞，0.1%吉姆薩染液（北京索萊寶科技有限公司，北京）染色細(xì)胞。細(xì)胞遷移測定在相同條件下進(jìn)行，上室不覆蓋基質(zhì)膠。最后所有細(xì)胞均于10×10倍顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 細(xì)胞周期與凋亡試驗(yàn) 細(xì)胞周期試驗(yàn)：收集并純化細(xì)胞，70%預(yù)冷的乙醇（生工生物工程有限公司，上海）固定細(xì)胞12 h，PBS 洗去乙醇，與核糖核酸酶A（10 mg/mL，BD Biosciences，美國）37℃反應(yīng)30 min，碘化丙啶（10 μg/mL，BD Biosciences，美國）避光染色30 min。流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，美國）分析細(xì)胞周期，采用FlowJo 7.61軟件評估G0-G1、S和G2-M期細(xì)胞的百分比。

細(xì)胞凋亡試驗(yàn)：用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，無雙抗的培養(yǎng)基終止消化，收集并重懸細(xì)胞，分別加5 μL碘化丙啶和5 μL Annexin V-FITC染液（細(xì)胞凋亡試劑盒，BD Biosciences，美國）避光染色20 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。t檢驗(yàn)用于比較組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MEX3A在NSCLC中高表達(dá)

本研究對在云南省腫瘤醫(yī)院收集的15例宣威地區(qū)肺癌樣本（癌和癌旁組織）進(jìn)行mRNA 轉(zhuǎn)錄組芯片分析（表2），共篩選出2 724個差異表達(dá)的基因，606個基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，2 118個基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因中，MEX3A、ARHGAP40、GPR110、FLJ13744、PSAT1、B3GNT6、FUT2、MND1、CXCL13、MUC21 上調(diào)倍數(shù)均高于6倍（P＜0.05，表3）。通過篩查基因背景后，選擇表達(dá)效果明顯的MEX3A基因（P＜0.01，表3）作為研究對象。對TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析顯示，與正常組織（n=20）相比，MEX3A mRNA 在肺腺癌組織（n=226）中顯著高表達(dá)（P＜0.001，圖1A）。

qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁細(xì)胞系BEAS-2B 相比，A549、NCI-H292 細(xì)胞系中MEX3A mRNA表達(dá)水平顯著高于BEAS-2B（P＜0.001，圖1B）。此外，qRTPCR結(jié)果顯示沉默MEX3A（siMEX3A）后，A549和NCI-H292的MEX3A的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001，圖1C）。

表2 新鮮組織樣本臨床病理資料

表3 mRNA轉(zhuǎn)錄組芯片篩選出在NSCLC中上調(diào)的mRNAs

圖1 MEX3A在NSCLC中高表達(dá)

2.2 沉默MEX3A對NSCLC增殖的影響

CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組（siNC）相比，沉默MEX3A后，A549和NCI-H292的增殖能力均被顯著抑制（P＜0.05，圖2）。

2.3 沉默MEX3A對NSCLC侵襲及遷移的影響

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，沉默MEX3A后A549和NCI-H292細(xì)胞的侵襲（P＜0.001）及遷移（P＜0.001）能力均明顯減弱（圖3）。

2.4 沉默MEX3A對NSCLC凋亡的影響

流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，MEX3A被沉默后促進(jìn)A549（P＜0.05）和NCI-H292（P＜0.001）的凋亡（圖4）。

2.5 沉默MEX3A對NSCLC周期的影響

流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默MEX3A后A549及NCI-H292中G2/M期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞周期均被阻滯于G2/M期（P＜0.001，圖5）。

圖2 沉默MEX3A基因后抑制NSCLC的增殖

圖3 沉默MEX3A基因后抑制NSCLC的侵襲及遷移

圖4 沉默MEX3A基因后誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡

圖5 沉默MEX3A基因后阻滯NSCLC細(xì)胞周期

3 討論

NSCLC的靶向治療已取得突破性進(jìn)展[10]，但由于診斷和治療方法有限，導(dǎo)致NSCLC患者的生存和預(yù)后仍不理想。遺傳因素是引起NSCLC的主要原因，研究表明，超過40%NSCLC是由未知基因異常表達(dá)引起的[11]。因此，找到NSCLC的相關(guān)生物標(biāo)志物，并了解其致癌機(jī)制，對NSCLC的早期診斷和尋找治療靶點(diǎn)極為重要。

MEX3是在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類翻譯調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白能抑制蛋白翻譯過程[12]。MEX3 包含MEX3A、MEX3B、MEX3C、MEX3D基因[3]，已有研究表明，MEX3蛋白的相關(guān)基因異常表達(dá)會引起胚胎死亡[12]。其中MEX3A與MEX3B是P小體的組成部分，P小體可濃縮細(xì)胞質(zhì)中的酶，進(jìn)而參與mRNA的調(diào)控過程[13-14]。現(xiàn)已有證據(jù)表明MEX3A可通過介導(dǎo)mRNA的代謝過程，參與細(xì)胞的生命進(jìn)程。MEX3A基因的異常表達(dá)會引起癌癥等多種疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，MEX3A是腎母細(xì)胞瘤潛在的致癌基因[7]，但MEX3A在NSCLC中的表達(dá)效果及其相關(guān)功能卻鮮見研究。因此，本文對MEX3A在NSCLC中的表達(dá)與功能進(jìn)行探索。首先，通過轉(zhuǎn)錄組芯片分析篩選出在NSCLC中表達(dá)上調(diào)最顯著的MEX3A基因。為探索MEX3A基因在NSCLC中的表達(dá)水平，對TCGA數(shù)據(jù)庫中226例肺腺癌樣本和20例正常樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MEX3A mRNA在肺腺癌組織（n=226）中顯著高表達(dá)（P＜0.001），與此同時qRT-PCR的結(jié)果也顯示MEX3A mRNA在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H292中表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。以上結(jié)果均表明MEX3A在NSCLC中顯著高表達(dá)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾技術(shù)沉默MEX3A基因后膀胱癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，且凋亡效率明顯增加[15-16]，Shi等[8]也發(fā)現(xiàn)MEX3A能促進(jìn)乳頭狀膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖和遷移，但卻鮮有MEX3A 對NSCLC影響的相關(guān)研究。因此，為進(jìn)一步探索MEX3A在NSCLC中的功能，本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默A549和NCI-H292的MEX3A基因，結(jié)果提示沉默MEX3A后NSCLC的增殖（P＜0.05）、侵襲（P＜0.001）及遷移（P＜0.001）能力均明顯減弱，提示MEX3A可能作為NSCLC的異?；?qū)е翹SCLC 異常增殖并失去接觸抑制，而沉默MEX3A基因能降低上述異常功能。

細(xì)胞的增殖和凋亡與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，細(xì)胞周期調(diào)控異常會導(dǎo)致細(xì)胞增殖及凋亡異常，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。G2/M期是DNA損傷修復(fù)的重要時期，G2/M期被阻滯使DNA 損傷無法被修復(fù)而走向凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，MEX3A基因在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，主要在胃癌細(xì)胞的G2/M期發(fā)揮作用從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲，而沉默MEX3A能有效抑制該過程[6]，亦有研究表明MEX3A可以影響腸細(xì)胞的分化和細(xì)胞周期進(jìn)程[17]。但目前尚缺乏關(guān)于MEX3A對NSCLC細(xì)胞凋亡和周期的影響的相關(guān)報道，本研究發(fā)現(xiàn)沉默MEX3A基因后A549和NCIH292細(xì)胞被明顯阻滯于G2/M期（P＜0.001），A549和NCIH292 細(xì)胞凋亡顯著上升（P＜0.05）。結(jié)果提示沉默MEX3A基因可導(dǎo)致NSCLC被阻滯于G2/M期，并最終誘導(dǎo)NSCLC凋亡。

綜上所述，MEX3A可能作為促癌基因參與了NSCLC細(xì)胞的生長和增殖過程，而沉默MEX3A能降低該過程。該研究為繼續(xù)探究MEX3A的相關(guān)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，提示MEX3A或許可作為NSCLC診斷和治療的標(biāo)志物，為攻克NSCLC提供新的靶點(diǎn)。