苗嘉桐， 侯興棟， 夏思遠(yuǎn)， 鄧憶美， 付維哲， 孫鐵英 ， 姜 濤*

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116044)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的呼吸道傳染病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球因結(jié)核病死亡人數(shù)達(dá)到130萬，新發(fā)病例數(shù)約100萬[1]。因此，成功研發(fā)新一代抗結(jié)核藥是目前需要解決的難題之一。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是茶多酚的主要成分[2]，在抗衰老、抗菌以及防治癌癥等多方面具有重要作用[3]。但受自身理化性質(zhì)的限制，其生物活性不能充分發(fā)揮，存在脂溶性差、生物利用率低、生理環(huán)境下不穩(wěn)定和體內(nèi)吸收緩慢等問題，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用中受到限制。因此，對EGCG進(jìn)行分子修飾已勢在必行。茶多酚具有大π鍵的共軛體系強(qiáng)配位的氧原子與合適的空間構(gòu)型，可以作為金屬離子的良好配體，為茶多酚的分子修飾提供了理想的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前研究表明，金屬離子對茶多酚的抗氧化活性、抗腫瘤作用具有一定影響[4-6]。近年來研究證實(shí)，中草藥中的有機(jī)成分與金屬離子結(jié)合后，其生物活性提高，甚至可以產(chǎn)生新的藥理作用[7]。鋅是人體生長發(fā)育不可缺少的金屬元素，廣泛參與細(xì)胞代謝，是許多酶發(fā)揮活性的必要輔助因子，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的作用，也被用作生物抗氧化劑。EGCG與鋅鹽反應(yīng)后生成的化合物可能兼有EGCG和Zn的雙重生物活性，使其應(yīng)用更為廣泛。前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠抑制恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatismc2155)的生長[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG與LB液體培養(yǎng)基相互作用，誘發(fā)EGCG代謝物的產(chǎn)生。進(jìn)而擬用鋅鹽制備EGCG金屬化合物，揭示鋅鹽對EGCG結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)活性的影響，為EGCG的進(jìn)一步研究開發(fā)提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 恥垢分枝桿菌Mycobacteriumsmegmatismc2155菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.2 主要試劑 綠茶(購自陜西省商南縣)；EGCG標(biāo)準(zhǔn)品(購自浙江乾盛康藥業(yè)有限公司)；醋酸鋅二水合乙酸鋅(分析純AR500 g，西隴化工化學(xué)試劑公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Binary HPLC Pump高壓液相色譜儀(JEOL)；Hypersill BDS C18色譜柱(Thermo)；pHs-3C型精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；GSKP01隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；FD-1B-50低溫真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 EGCG處理前后恥垢分枝桿菌生長曲線的測定 挑取M.smegmatismc2155/pSMT1單菌落，接種在5 mL含40 μg/mL潮霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃孵育24 h。以LB培養(yǎng)基為對照(control)，以終濃度為20 μg/mL EGCG的LB培養(yǎng)基為處理組，按1∶100接種菌液并在37 ℃培養(yǎng)，從第10小時(shí)起每4 h取出菌液200 μL，加入2 μL 1%的十二奎醛作為細(xì)菌熒光素酶的底物，鋪在白色不透明的96孔板中進(jìn)行熒光檢測，用M.smegmatis/pSMT1校正過的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線處理數(shù)據(jù)，繪制野生型恥垢分枝桿菌和20 μg/mL的EGCG處理下的生長曲線[9]。

1.2.2 HPLC和LC/MS方法檢測EGCG的含量和結(jié)構(gòu) 野生型恥垢分枝桿菌中加入終濃度為20 μg/mL的EGCG，37 ℃培養(yǎng)48 h，每間隔6 h取6 mL菌液，其中5 mL菌液進(jìn)行100 W 超聲2 s，間隔2 s，共5次超聲處理。分別進(jìn)行8 000 g離心10 min，保留上清備用。利用Hypersill BDS C18色譜柱系統(tǒng)檢測EGCG的含量。洗脫程序如下：流動(dòng)相A，2%乙酸；流動(dòng)相B，乙腈；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；加樣量10 μL。用LB培養(yǎng)基配制EGCG標(biāo)準(zhǔn)品作為對照,濃度0.02 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后按HPLC洗脫程序進(jìn)行操作。利用HPLC檢測EGCG的含量，LC/MS方法鑒定恥垢分枝桿菌處理18 h后EGCG的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3 EGCG-Zn2+的化學(xué)合成及紫外吸收分光光度法鑒定 將0.65 g的EGCG標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL蒸餾水中，采用pHs-3C型精密pH計(jì)，加入1 mol/L的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為7[10]，在磁力攪拌器攪拌下緩慢加入1.25 g鋅鹽，反應(yīng)30 min，靜置30 min，然后過濾，洗滌。洗滌后的上層清液用NaHCO3檢驗(yàn)直至無沉淀生成，經(jīng)抽濾過后，得到深紅褐色產(chǎn)物，用玻璃棒小心剝離，烘干后得產(chǎn)物。通過化學(xué)試劑沉淀法，將所得到的深紅褐色產(chǎn)物用稀H2SO4溶解后，取少量在試管中，加入NaHCO3溶液，觀察試管中沉淀情況，進(jìn)行初步鑒定。多酚類物質(zhì)由于含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行檢測通常采用紫外吸收光譜法。將EGCG標(biāo)準(zhǔn)品和化學(xué)合成所得的深紅褐色產(chǎn)物，分別以無水乙醇稀釋，使其終濃度均為3×10-5mol/L,在200～300 nm之間，每隔10 nm測其吸光度，并繪制曲線。

1.2.4 紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測抑菌作用 將EGCG標(biāo)準(zhǔn)品和化學(xué)合成產(chǎn)物分別用甲醇配制成濃度為2 mg/mL的儲存液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后，加入EP管中保存?zhèn)溆?。然后在每個(gè)EP管中放入滅菌后的濾紙片，浸泡過夜，第2天放入烘箱烘干，于4 ℃保存?zhèn)溆?。?∶200稀釋恥垢分枝桿菌菌液，取50 μL菌液滴于平板上，均勻涂抹，在平板上小心放入之前準(zhǔn)備好的濾紙片，并進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記。平板經(jīng)室溫放置5 min后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察EGCG和EGCG-Zn2+作用下的抑菌圈大小，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對恥垢分枝桿菌的抑制作用

由圖1可知，與對照組(control)相比，20 μg/mL的EGCG處理組對恥垢分枝桿菌生長具有明顯抑制作用，EGCG處理10 h后出現(xiàn)抑制作用，18 h抑制作用最為明顯，18 h以后抑制作用明顯減弱。

2.2 恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基中EGCG含量變化

隨著EGCG處理時(shí)間延長，恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基上清中EGCG含量逐漸下降，直到30 h后，培養(yǎng)上清中不能檢測到EGCG。EGCG處理恥垢分枝桿菌后30 min 培養(yǎng)上清中EGCG含量出現(xiàn)明顯變化，推測EGCG可能與恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁相互結(jié)合有關(guān)。利用超聲處理方法，使其黏附于細(xì)胞壁上的EGCG重新釋放到培養(yǎng)基中，再進(jìn)行檢測。分別取EGCG處理后6、18和24 h的樣品進(jìn)行超聲處理后進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果表明， EGCG處理6 h后，超聲處理前后培養(yǎng)上清中EGCG含量無明顯變化； EGCG處理18 h后，超聲處理導(dǎo)致培養(yǎng)基中EGCG含量明顯變化(圖2)。由此可見，培養(yǎng)基中EGCG含量的減少可能是因?yàn)镋GCG黏附在細(xì)胞壁的表面，也可能經(jīng)過代謝或與其他離子結(jié)合而使特定結(jié)構(gòu)的EGCG含量減少[11]。

圖1 EGCG處理的恥垢分枝桿菌的生長曲線

2.3 恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基中EGCG的結(jié)構(gòu)變化

EGCG的分子量為458.4。LC/MS結(jié)果表明，EGCG對照組在m/z為457 [M-H]-處出現(xiàn)明顯峰值，與相應(yīng)分子量的EGCG相對應(yīng)。

圖2 超聲處理前后的培養(yǎng)基中EGCG含量比較分析Fig.2 The comparative analysis of EGCG content in culture mediumbefore and after ultrasonic treatment

EGCG與恥垢分枝桿菌作用后，EGCG質(zhì)譜圖中,在1.18、3.35、3.53 min 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)峰值分別進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。與對照組相比，m/z出現(xiàn)127.8、199.1、382.9、453、473以及489特異性峰值。這些分子可能是EGCG與LB培養(yǎng)基中離子結(jié)合后的產(chǎn)物,如473[M+OH]-等,也有可能是EGCG的代謝產(chǎn)物。為驗(yàn)證EGCG的離子結(jié)合能力及其影響，選用鋅離子做進(jìn)一步研究。

2.4 EGCG-Zn2+的化學(xué)合成及分析

經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)后，得到深紅褐色產(chǎn)物，初步鑒定為EGCG-Zn2+，但其中含有大量白色固體，應(yīng)為未反應(yīng)的乙酸鋅或碳酸鋅。經(jīng)分離稱量，本研究中，EGCG-Zn2+合成率為16.3%。紫外吸收光譜法鑒定結(jié)果表明，高于200 nm處的較強(qiáng)吸收是由于芳環(huán)中π-π*躍遷引起的，是芳香化合物的特征吸收帶，眾多的酚羥基是影響EGCG紫外吸收的主要因素。EGCG分子結(jié)構(gòu)中存在較多的酚羥基，它的λmax出現(xiàn)在波長200～300 nm。

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品與EGCG金屬化合物的最大吸收波長和吸收強(qiáng)度有所不同，但EGCG-Zn2+在紫外光區(qū)仍有明顯的酚羥基吸收(圖3)。研究結(jié)果表明，EGCG和EGCG-Zn2+的紫外吸收光譜明顯不同，也證明了EGCG-Zn2+的合成。進(jìn)一步HPLC分析顯示，EGCG標(biāo)準(zhǔn)品的主要峰值保留時(shí)間為6.621 min，峰面積所占比例為46.98%；而EGCG-Zn2+主要峰值保留時(shí)間為9.079 min，峰面積所占比例為47.98%(圖4)。所以，EGCG與Zn2+作用后，出峰時(shí)間明顯變化。

圖3 EGCG和EGCG-Zn2+的紫外吸收光譜Fig.3 The ultraviolet absorption spectrum of EGCG and EGCG-Zn2+

圖4 EGCG和EGCG-Zn2+的HPLC分析

2.5 EGCG和EGCG-Zn2+抑菌作用的比較

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法比較EGCG與EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌抑菌作用。結(jié)果表明，2 mg/mL的EGCG標(biāo)準(zhǔn)品和2 mg/mL的EGCG-Zn2+均出現(xiàn)抑菌圈現(xiàn)象，抑菌圈直徑分別為16 mm和12 mm。表明在該濃度下，EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌具有一定的抑菌作用，但其抑菌作用明顯弱于EGCG標(biāo)準(zhǔn)品。

3 討 論

近年來，茶多酚的抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等生物活性研究已被廣泛報(bào)道，但EGCG金屬化合物的生物學(xué)活性研究報(bào)道較少。最近研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物或藥物經(jīng)金屬離子修飾后活性發(fā)生變化[12-13]。許多金屬離子對于人體的正常生長發(fā)育是至關(guān)重要的，而天然產(chǎn)物或藥物經(jīng)金屬離子修飾后可能兼顧兩者的性質(zhì)，達(dá)到更好的作用效果[14]。例如，納豆激酶(Nattokinase,NK)是一種新型食源性纖溶酶，具有很強(qiáng)的溶血栓作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)Mg2+修飾，提高了納豆激酶的活性，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性[15]。另外，金屬離子修飾糖類化合物后可作為食品功能因子廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)，具有無污染、水溶性好、陰離子性等特性，是生物體金屬補(bǔ)充劑的很好選擇，具有重要生物意義[16]。

恥垢分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌的模式菌，具有相似的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。前期研究表明，綠茶粗提物及其主要成分EGCG能抑制恥垢分枝桿菌的生長[8]。本研究表明，EGCG的含量和結(jié)構(gòu)容易受內(nèi)外因素影響，在恥垢分枝桿菌培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)了EGCG的不同代謝物，在Zn離子作用下，EGCG出峰時(shí)間延長，說明其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化。而鋅是一種重要的微量元素，正常人體內(nèi)含鋅約2～3 g，它對于人體正常成長和發(fā)育是必不可少的[15]。已有資料表明，鋅鹽已作為一種藥物應(yīng)用于臨床[16]。將鋅鹽與EGCG結(jié)合形成新型EGCG來研究對恥垢分枝桿菌的抑菌作用將對EGCG的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。研究結(jié)果表明，EGCG-Zn2+對恥垢分枝桿菌具有抑菌作用，但該作用明顯減弱。有文獻(xiàn)報(bào)道，在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，茶多酚鋅的抗氧化能力明顯強(qiáng)于茶多酚[17]。因此，鋅鹽雖然加強(qiáng)了EGCG的抗氧化能力，但卻降低了其對恥垢分枝桿菌的抑菌作用，這些都為今后研究新型EGCG金屬化合物，如EGCG-Ag+提供了思路。

1965年，Moyer研究發(fā)現(xiàn)硝酸銀溶液對葡萄狀球菌、鏈狀球菌等有抗菌活性[18]。用途最廣的是磺胺嘧啶銀，它作為一種抗菌劑被廣泛用于嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)的抗菌消毒以防止細(xì)菌感染[19-20]?；粽摰萚21]合成了新的外用抗菌藥物氟哌酸銀，它具有強(qiáng)大的廣譜殺菌作用。因此，Ag離子可能會(huì)大大加強(qiáng)EGCG的抑菌作用，為將來研究新型抗結(jié)核病藥物(EGCG-Ag+)制劑提供了寶貴的思路。