魏溪垚， 劉 秋， 于基成

(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600)

提高放線菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量或獲得新型抗生素是抗生素研究領域的研究熱點。通常提高放線菌抗生素產(chǎn)量的技術包括誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因重組等。近年來，利用微生物間的協(xié)同作用提高微生物活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也日益受到關注。徐淑蓓等[1]報道紅曲霉、紅茶菌及其與鹿角靈芝菌復合發(fā)酵后對靈芝菌胞外多糖產(chǎn)量均有明顯影響，紅曲霉與鹿角靈芝菌復合發(fā)酵后,靈芝菌胞外多糖產(chǎn)量增加15%;不同紅茶菌分離菌株對促進鹿角靈芝胞外多糖的產(chǎn)生影響有所不同。張凡凡[2]通過將纖維素分解菌與不同發(fā)酵類型乳酸菌作為復合菌劑發(fā)酵青貯玉米，以期利用微生物間的協(xié)同作用提質(zhì)降耗。鄒曉等[3]利用白黑粉菌(Ustilagoesculenta)與紫紅曲霉(Monascusperpureuss)共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)到第8天洛伐他汀產(chǎn)量提高了203%。但目前的誘導作用多是關于利用真菌誘導處理植物細胞培養(yǎng)物，進行混合培養(yǎng)，促進植物細胞大量合成次級代謝產(chǎn)物的報道。許建峰等[4]利用6種真菌誘導物對高山紅景天細胞生長與紅景天甙積累的影響，其中以黑曲霉誘導物效果最好。在細胞培養(yǎng)初期添加質(zhì)量濃度為10 mg/L的黑曲霉誘導物能使培養(yǎng)細胞中紅景天甙含量提高0.995%。前體與誘導物調(diào)控組合的運用，最終使紅景天甙產(chǎn)量達到167.4 mg/L,是對照培養(yǎng)的3.5倍。而利用真菌誘導微生物積累次生代謝方面的研究卻相對較少。隨著細菌和真菌基因組研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)通過某些小分子的刺激可激活胞內(nèi)一些沉默途徑，尤其是一些次級代謝產(chǎn)物合成的基因簇，從而獲得比傳統(tǒng)發(fā)酵更多的代謝產(chǎn)物[5]。因此，近年來有研究者在利用真菌誘導微生物生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物方面進行了大膽嘗試，并在類胡蘿卜素、海洋生物堿、靈芝多糖和靈芝酸、Monacolin K 和DMA 等方面取得了許多可喜成果[6-7]。本研究以真菌作為誘導菌株，評價其對放線菌龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)MY02活性的影響，并對其誘導條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 龜裂鏈霉菌(S.rimosus)MY02、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf sp.cucumarinum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、香菇真菌(Lentinusedodes)均來自大連民族學院功能微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①菌株MY02發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g, 蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g, KH2PO42 g ，蒸餾水1 000 mL，pH自然；②PD培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；③PDA培養(yǎng)基：在PD培養(yǎng)基基礎上添加18 g瓊脂制備成固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器與設備 高壓蒸汽滅菌鍋(5Y0264，日本三洋電子有限公司)，天美多功能冷凍離心機(CT15RT，北京格瑞恩科技發(fā)展公司)，全溫培養(yǎng)搖床(211B，上海智城分析儀器制造有限公司)，超凈工作臺(ZHJH-C1112C，上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 真菌對菌株MY02活性的誘導作用 分別以康寧木霉和香菇真菌作為誘導菌株，以放線菌龜裂鏈霉菌MY02作為被誘導菌株，采用間隔對峙培養(yǎng)方法，即制備PDA平板培養(yǎng)基，將PDA平板分為5個平行區(qū)域，分別將菌株MY02與康寧木霉間隔對峙培養(yǎng)，最中間區(qū)域密集涂布誘導菌，然后依次密集涂布菌株MY02和誘導菌(圖1)。涂布完成后于28 ℃培養(yǎng)7 d。以黃瓜枯萎病菌作為指示菌，評價經(jīng)誘導后菌株MY02的活性變化。對峙培養(yǎng)結(jié)束后，用打孔器取經(jīng)過對峙培養(yǎng)后的菌株MY02菌塊。將菌塊分別置于含有指示菌的PDA固體平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，以未經(jīng)對峙培養(yǎng)的菌株MY02菌塊作為對照，十字交叉法測量抑菌圈直徑，評價誘導菌株對菌株MY02活性的誘導作用。

1.2.2 康寧木霉誘導液的制備 將康寧木霉真菌(孢子濃度106個/mL)接種于PD培養(yǎng)液中，25 ℃，140 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液于10 000 r/min 離心20 min，上清液即為康寧木霉誘導液，將制備的康寧木霉誘導液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 菌株MY02與誘導菌間隔培養(yǎng)Fig.1 Isolated culture of actinomycetes and inducible bacteria

1.2.3 康寧木霉誘導液接種量對菌株MY02活性的影響 菌株MY02發(fā)酵至36 h，分別接入裝液量的0.2%、2%、20%上述制備的康寧木霉誘導液，28 ℃，140 r/min繼續(xù)發(fā)酵5 d。發(fā)酵結(jié)束后，測定菌株MY02的發(fā)酵液活性，以未添加誘導液的菌株MY02發(fā)酵液活性為對照，比較康寧木霉誘導液對菌株MY02活性的影響。

1.2.4 康寧木霉添加時間對菌株MY02活性的影響 在菌株MY02發(fā)酵的不同階段(0、12、24、36、48 和60 h)，分別按照2%的量添加培養(yǎng)6 d 的康寧木霉誘導液，以確定誘導液的最佳添加時間。

1.2.5 康寧木霉誘導菌株的誘導組分初步分離 取100 mL發(fā)酵6 d的康寧木霉誘導菌株的發(fā)酵物，采用以下方式分別得到誘導菌株的4種組分。用6層無菌紗布將菌絲體與發(fā)酵液分開，將過濾獲得的菌絲體用無菌水洗滌3次，洗去表面培養(yǎng)基，8 000 r/min離心20 min，棄上清。將菌絲體沉淀置于50 mL離心管中，超聲破碎后，12 000 r/min離心10 min，將上清液與沉淀分開，沉淀標記為組分Ⅰ；菌絲沉淀離心得到的上清為細胞破碎釋放的內(nèi)含物，標記為組分Ⅱ；紗布過濾后得到的發(fā)酵液再用0.22 μm濾膜除菌，標記為組分Ⅲ；組分Ⅲ經(jīng)高溫高壓處理后標記為組分Ⅳ。

1.2.6 康寧木霉誘導菌株的誘導組分分析 將康寧木霉誘導菌株的發(fā)酵液真空濃縮，乙醇沉淀，8 000 r/min離心20 min，將沉淀與上清液分開，乙醇沉淀物于65 ℃烘干后，再用100 mL雙蒸水復溶，標記為組分Ⅴ，主要成分為蛋白質(zhì)及多糖；上清液真空濃縮除去乙醇，同樣用100 mL雙蒸水溶解，標記為組分Ⅵ，命名為FECS。組分Ⅴ采用Sevag試劑除蛋白4次，然后用透析袋除鹽，得到的組分命名為EPS。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同真菌對菌株MY02活性的誘導作用

當菌株MY02分別與香菇真菌和康寧木霉共培養(yǎng)時，均能顯著提高菌株MY02的活性，其抑菌圈直徑分別從對照(無誘導菌株)的18.2 mm增至27.0 mm和34.6 mm，可見兩種真菌均對菌株MY02具有明顯的活性誘導作用(圖2)。其中康寧木霉對菌株MY02具有更高的誘導活性，因此，后續(xù)實驗初步評價了康寧木霉不同組分對菌株MY02的誘導效果。

2.2 康寧木霉誘導液接種量對菌株MY02活性的影響

當接種量為2%時，共培養(yǎng)的混合發(fā)酵液中菌株MY02的活性最高，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為(31.3±0.1) mm。因此，2%為最佳誘導菌株接種量(圖3)。

圖2 不同真菌對菌株MY02活性的誘導作用Fig.2 Induction of MY02 activity by different Fungia：菌株MY02單獨培養(yǎng)的抑菌活性；b：菌株MY02與香菇真菌共培養(yǎng)后的抑菌活性；c：菌株MY02與康寧木霉共培養(yǎng)后的抑菌活性a： Antifungal activity of S. rimosus MY02 cultured alone; b： Antifungal activity of S. rimosus MY02 co-cultured with Lentinus edodes; c： Antifungal activity of S. rimosus MY02 co-cultured with T. koningii

圖3 誘導菌株接種量對菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.3 Effect of induced strain inoculation quantity on antifungal activity of strain MY02

2.3 康寧木霉誘導菌的發(fā)酵液添加時間對菌株MY02活性的影響

由圖4可知，誘導菌株發(fā)酵液接種時間在0～36 h時，隨著誘導菌株發(fā)酵液接種時間的增長，抑菌圈直徑隨之增大，菌株MY02的活性也隨之增強。當誘導菌株接種時間為菌株MY02發(fā)酵36 h時，發(fā)酵液活性最大，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為(31.3±0.1) mm。36 h后，隨誘導菌株接種時間的延長，抑菌圈直徑減小。因此，選擇誘導菌株發(fā)酵液在菌株MY02發(fā)酵36 h時為最佳添加時間。

2.4 誘導菌株誘導組分的初步分析

按照1.2.5處理后分別得到4種康寧木霉誘導組分，由圖5可知，4種誘導組分的誘導效果不盡相同。其中菌株MY02在分別添加誘導組分菌絲沉淀物(組分Ⅰ)和菌絲裂解液(組分Ⅱ)發(fā)酵后，菌株MY02抗真菌活性沒有增加，說明康寧木霉菌絲及其裂解液沒有誘導活性。處理方式Ⅲ和處理方式Ⅳ，即除掉菌絲的發(fā)酵液以及經(jīng)過高溫高壓處理的除掉菌絲的發(fā)酵液添加到MY02培養(yǎng)基中，菌株MY02的抗真菌活性較對照組均有所提高。其中組分Ⅲ對MY02 抗真菌活性誘導作用最強(抑菌圈直徑為(31.3±0.9) mm，說明康寧木霉對菌株MY02抗真菌活性的誘導組分在發(fā)酵液中,且誘導組分抗高溫。

圖4 誘導菌株接種時間對菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.4 Effect of induced strain inoculation time on antifungal activity of strain MY02

圖5 誘導菌株發(fā)酵液不同組分對菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.5 Effect of different components of induced fermentation broth on antifungal activity of strain MY02

由圖6可知，在菌株MY02發(fā)酵36 h時，添加等濃度等體積的FECS和EPS對MY02抗真菌活性都有促進作用。FECS為菌株MY02發(fā)酵液的乙醇沉淀物，其組分包括蛋白和多糖大分子物質(zhì)，EPS則是通過Sevag法去除蛋白，其主要組分為多糖類物質(zhì)，由此可見，康寧木霉發(fā)酵產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)為主要誘導組分，能夠明顯誘導增強菌株MY02的抗真菌活性。

圖6 誘導菌株發(fā)酵液不同組分對菌株MY02抗真菌活性的影響Fig.6 Effect of different components of induced strain fermentation broth on antifungal activity of strain MY02

3 討 論

目前，關于真菌誘導子作用機制的研究多集中于對植物次級代謝產(chǎn)物的誘導活性上，利用真菌誘導微生物積累次生代謝方面的研究卻相對較少，對真菌誘導子與微生物細胞間相互作用的研究也相對滯后。但是近年來很多人對其進行了研究。梁楚欣等[8]報道，真菌誘導子以其獨有的優(yōu)勢, 成為提高長春花中萜類吲哚生物堿含量的其中一種重要手段。而王紅[9]報道，采用3種真菌誘導子，即大麗花輪枝孢(Verticilliumdahliae)、葡枝根霉(Rhiczopusstolonifer)和束狀刺盤孢(Colletotrichumdematium)分別處理青蒿，3種真菌誘導子對青蒿發(fā)根生長和青蒿素生物合成有明顯正向誘導的影響。黃曲霉真菌誘導子[10]對長春花形成層分生組織細胞內(nèi)萜類吲哚生物堿產(chǎn)生的影響。王亞洲等[11]報道，產(chǎn)黃青霉真菌和黑曲霉真菌制備的類似于丁醇的誘導子能有效促進納他霉素的合成。Wang[12]研究了真菌誘導劑對納他鏈霉菌HW-2理化及微生物響應的影響。結(jié)果表明，誘導子能使干細胞重量(DCW)降低17.7%，提高了葡萄糖的利用率。李文淵等[13]報道了生物和非生物誘導子對丹參有效成分次生代謝具有誘導和調(diào)控作用。

Charusanti等[14]提出和病原菌的競爭會誘導鏈霉菌發(fā)生適應進化，從而產(chǎn)生新的抗生素來抑制病原菌的假說，利用基于競爭的自適應進化策略篩選產(chǎn)生新化合物或提高己有化合物產(chǎn)量的突變株。

目前，人們對康寧木霉的研究多集中在其高產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶等機制及應用研究上[15]，而對其誘導鏈霉菌活性提高的研究則鮮有報道。本研究評價了康寧木霉對龜裂鏈霉菌MY02的誘導活性及其誘導組分的初步分析。其結(jié)果顯示，當以康寧木霉和香菇真菌作為誘導菌株時，發(fā)現(xiàn)二者對MY02的抗真菌活性均具有明顯的正向誘導作用。當以康寧木霉作為誘導菌時，其最佳誘導條件為接種量為2%，發(fā)酵36 h時為最佳添加時間。同時，通過初步分析可知，康寧木霉的誘導組分為發(fā)酵產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)。