劉 柳， 張 琨， 鄧百萬(wàn)*， 萬(wàn) 一*

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000;2.陜西省微生物研究所 分子生物學(xué)研究中心，陜西 西安 710043;3.陜西省科學(xué)院 秦嶺天然產(chǎn)物工程中心，陜西 西安 710043)

絲狀真菌種類(lèi)繁多，廣泛存在于地球生物圈中，是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1]。作為重要的生物資源，絲狀真菌在工業(yè)[2]、醫(yī)藥[3]、食品[4]、生物防治[5]、生態(tài)環(huán)境[6]等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)絲狀真菌的開(kāi)發(fā)利用首先需要對(duì)菌種進(jìn)行分類(lèi)鑒定，高效獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板是對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定的必要條件[7]。由于絲狀真菌細(xì)胞壁成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)特殊，尤其是較高的幾丁質(zhì)含量增加了細(xì)胞壁的抗逆性，難以釋放出菌體DNA，因此，獲取PCR反應(yīng)模板的過(guò)程較為復(fù)雜[8]。目前，最常用的方法是利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[9-10]、十二烷基磺酸鈉(SDS)法[11]、氯化芐法[12]、尿素法[13]、蝸牛酶法[14]等獲取絲狀真菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板。上述方法雖然適用于絕大部分絲狀真菌，但操作耗時(shí)費(fèi)力，并且不同方法適用的絲狀真菌類(lèi)群存在差異[15]，不適合絲狀真菌的批量、快速鑒定。為了提高絲狀真菌PCR鑒定效率，快速高效獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板顯得尤為重要。研究表明，玻璃珠法可以借助玻璃珠之間相互振動(dòng)擠壓及剪切力快速破碎細(xì)胞壁[16]；加熱裂解法可以利用產(chǎn)生的高溫達(dá)到裂解細(xì)胞壁的目的[17]。另有研究報(bào)道，Chelex-100作為陽(yáng)離子螯合樹(shù)脂在高溫、低離子強(qiáng)度下可以絡(luò)合金屬離子，避免模板DNA 降解，快速獲取用于PCR反應(yīng)模板的DNA[18-21]。本文結(jié)合相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索，利用機(jī)械破壁儀聯(lián)合微波爐共同作用對(duì)絲狀真菌細(xì)胞壁進(jìn)行裂解，快速獲得PCR反應(yīng)模板，提高絲狀真菌PCR鑒定效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)室分離自秦嶺昆蟲(chóng)體內(nèi)13株不同種屬的絲狀真菌：繩狀籃狀菌(Talaromycesfuniculosus)、澳大利亞腔孢菌(Cochliobolusaustraliensis)、層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、易脆毛霉(Mucorfragilis)、魯本斯青霉(Penicilliumrubens)、皺折裸胞殼(Emericelladentata)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、平臍蠕孢屬(Bipolaristetramera)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)、歧皺青霉(Penicilliumsteckii)、黑曲霉(Aspergillusniger)、擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)，如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)菌株圖片F(xiàn)ig.1 The pictures of experimental strain1：繩狀籃狀菌；2：澳大利亞腔孢菌；3：層生鐮刀菌；4：易脆毛霉；5：魯本斯青霉；6：皺折裸胞殼；7：鏈格孢菌；8：平臍蠕孢屬；9：黃曲霉；10：枝狀枝孢菌；11：歧皺青霉；12：黑曲霉；13：擬康寧木霉1：Talaromyces funiculosus；2：Cochliobolus australiensis；3：Fusarium proliferatum；4：Mucor fragilis；5：Penicillium rubens；6：Emericella dentata；7：Alternaria alternata；8：Bipolaris tetramera；9：Aspergillus flavus；10：Cladosporium cladosporioides；11：Penicillium steckii；12：Aspergillus niger；13：Trichoderma koningiopsis

1.1.2 主要試劑及儀器 引物ITS1、ITS4由上海捷瑞生物有限公司合成，ITS1:5′-TCCGTAGTTGAACCTGCGG-3′，ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGA-

TATGC-3′，10×Buffer TE由實(shí)驗(yàn)室自配，2×TaqMaster Mix(上海捷瑞生物有限公司)，5×Loading Buffer(上海捷瑞生物有限公司)，250 bp Maker(上海捷瑞生物有限公司)，真菌基因組試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，Chelex-100(Sigma 公司)，鋼珠(d=5 mm，QIAGEN Hilden)機(jī)械破壁儀(TissueLyser LT、QIAGEN Hilden)，微波爐(WD700TL23-K5，格蘭仕微波爐電器有限公司)，離心機(jī)(XI，基因公司)，酶標(biāo)儀(EPOCH2，BioTek)，PCR擴(kuò)增儀(T100TM，BIO-RAD)，凝膠電泳儀(DYY-100，北京市六一儀器廠(chǎng))，凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+，BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 PCR反應(yīng)模板制備 在無(wú)菌操作臺(tái)，取100 μL 10×Buffer TE(100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0)于2 mL離心管中，用無(wú)菌接種環(huán)挑取少半環(huán)菌絲體，迅速震蕩混勻，加一顆無(wú)菌鋼珠，先采用機(jī)械破壁儀進(jìn)行機(jī)械破壁，隨后對(duì)其進(jìn)行微波處理，待其溫度降至室溫，離心獲取上清液作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 機(jī)械破壁聯(lián)合微波法條件優(yōu)化 選取常見(jiàn)絲狀真菌黑曲霉Aspergillusniger為實(shí)驗(yàn)菌株，以PCR產(chǎn)物量為指標(biāo)，以30 Hz機(jī)械破壁2 min，微波560 W裂解5 min為基礎(chǔ)條件[22]，采取單因素法對(duì)機(jī)械破壁頻率(20、30、40、45、50 Hz)、機(jī)械破壁時(shí)間(0.5、1、2、3、4 min)、微波裂解功率(140、420、560、700 W)、微波裂解時(shí)間(1、3、5、8、10 min)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取PCR反應(yīng)模板的最佳條件。

1.2.4 ITS序列擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物量分析 分別將上述不同條件下得到的PCR反應(yīng)模板進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。反應(yīng)體系為30 μL：2×TaqMaster Mix 15 μL，引物ITS1 0.5 μL，引物ITS4 0.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 11 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，并以Maker條帶濃度為對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)帶濃度為10 ng/μL、加亮帶濃度為25 ng/μL)，通過(guò)Image Lab進(jìn)行PCR產(chǎn)量分析。

1.2.5 快速獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板方法的比較 采取上述實(shí)驗(yàn)得到的機(jī)械破壁聯(lián)合微波法的最佳條件獲取13株不同種屬絲狀真菌的PCR反應(yīng)模板，同時(shí)與機(jī)械破壁法、Chelex-100法得到的模板作對(duì)比，以試劑盒抽提法得到的基因組DNA為模板作陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增及目的條帶濃度分析，目的條帶清晰并在500～750 bp之間可認(rèn)為擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

機(jī)械破壁法：參照文獻(xiàn)[21]，取少半環(huán)菌絲體于裝有200 μL 10×Buffer TE的2 mL離心管中，加入一顆鋼珠，渦旋震蕩5 min后置于機(jī)械破壁儀中破壁2 min，12 000 r/min 離心2 min取上清液作為PCR反應(yīng)模板。

Chelex-100法：參照文獻(xiàn)[19]，取少半環(huán)菌絲體于裝有200 μL 10% Chelex-100溶液的2 mL離心管中，渦旋震蕩10 s，沸水浴10 min，冷卻至室溫后12 000 r/min 離心2 min取上清液作為PCR反應(yīng)模板。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械破壁聯(lián)合微波法條件優(yōu)化結(jié)果

機(jī)械破壁聯(lián)合微波法在不同條件下得到的結(jié)果如下：機(jī)械破壁頻率在40 Hz時(shí)，目的條帶最亮且PCR產(chǎn)物量最高為100.334 ng(圖2A、表1)；機(jī)械破壁時(shí)間在2 min時(shí)，目的條帶最亮且PCR產(chǎn)物量最高為82.868 ng，但1 min時(shí)，目的條帶清亮、PCR產(chǎn)物量為81.726 ng，與2 min時(shí)相差不大，從快速的角度考慮選取1 min為最佳機(jī)械破壁時(shí)間(圖2B、表2)；微波裂解功率在700 W時(shí)目的條帶最亮且PCR產(chǎn)物量最高為76.872 ng(圖2C、表3)；微波裂解時(shí)間在3 min時(shí)目的條帶最亮且PCR產(chǎn)物量最高為128.516 ng(圖2D、表4)。綜上所述，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法的最佳條件為40 Hz機(jī)械破壁1 min，微波700 W高溫裂解3 min。

2.2 快速獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板方法的比較

2.2.1 ITS序列擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)4種方法得到的PCR反應(yīng)模板進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。采用Chelex-100法獲取的PCR反應(yīng)模板可成功擴(kuò)增6株絲狀真菌的ITS序列，擴(kuò)增率雖然較低，但目的條帶明亮、清晰(圖3A1、A2)；采取機(jī)械破壁法獲取的PCR反應(yīng)模板，雖成功擴(kuò)增9株絲狀真菌的ITS序列，但目的條帶明亮度和清晰度明顯低于其他3種方法(圖3B1、B2)；試劑盒抽提法獲取的PCR反應(yīng)模板可成功擴(kuò)增13株絲狀真菌的ITS序列，且目的條帶明亮、清晰(圖3C1、C2)；機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取的PCR反應(yīng)模板成功擴(kuò)增13株絲狀真菌的ITS序列，且目的條帶明亮、清晰(圖3D1、D2)。因此，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法可快速、高效獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板。

圖2 ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of ITS sequence amplificationM：250 bp Maker； A：不同機(jī)械破壁頻率(泳道1～5：20、30、40、45、50 Hz)； B：不同機(jī)械破壁時(shí)間(泳道1～5：0.5、1、2、3、4 min)； C：不同微波裂解功率(泳道1～5：140、420、560、700 W)； D：不同微波裂解時(shí)間(泳道1～5：1、3、5、8、10 min)M: 250 bp Maker； A: Different mechanical wall-breaking frequency (lane1-5: 20，30，40，45，50 Hz)； B: Different mechanical wall-breaking time (lane1-5: 0.5，1，2，3，4 min) ； C: Different microwave power (lane1-5: 140,420,560,700 W)； D: Different microwave time (lane1-5: 1，3，5，8，10 min)

表1 不同機(jī)械破壁頻率對(duì)PCR產(chǎn)物量的影響

表2 不同機(jī)械破壁時(shí)間對(duì)PCR產(chǎn)物量的影響

2.2.2 PCR擴(kuò)增量及產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析 結(jié)果如表5所示，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取的PCR反應(yīng)模板擴(kuò)增后的目的條帶質(zhì)量濃度菌株1、2、8、10、11、12與試劑盒抽提法相當(dāng)，菌株3、4、5、6、7、9、13雖低于試劑盒抽提法，但條帶質(zhì)量濃度均大于20 ng/μL。

表3 不同微波裂解功率對(duì)PCR產(chǎn)物量的影響

表4 不同微波裂解時(shí)間對(duì)PCR產(chǎn)物量的影響

圖3 ITS序列擴(kuò)增結(jié)果 Fig.3 The results of ITS sequence amplificationM：250 bp Maker; 1～13：13株實(shí)驗(yàn)菌株; A1、A2：Chelex-100法; B1、B2：機(jī)械破壁法; C1、C2：試劑盒抽提法; D1、D2：機(jī)械破壁聯(lián)合微波法M: 250 bp Maker; 1-13:13 experimental strains; A1，A2: Chelex-100 method; B1，B2: Mechanical wall-breaking method; C1，C2: Kit method; D1，D2: Mechanical wall-breaking united microwave method

表5 目的條帶質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

機(jī)械破壁聯(lián)合微波法、試劑盒抽提法獲得模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法同試劑盒抽提法得到的鑒定結(jié)果一致。因此，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法可快速、高效獲取用于絲狀真菌PCR反應(yīng)的正確模板。

3 討 論

要提高絲狀真菌PCR鑒定效率，首先需要快速高效獲取PCR反應(yīng)模板。我們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)建立了機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板的方法，以PCR產(chǎn)物量為指標(biāo)，以常見(jiàn)絲狀真菌黑曲霉為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)機(jī)械破壁聯(lián)合微波法的機(jī)械破壁頻率、機(jī)械破壁時(shí)間、微波裂解功率、微波裂解時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化，得到了機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板的最佳條件：40 Hz機(jī)械破壁1 min，微波700 W高溫裂解3 min。

采取優(yōu)化的機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取13株不同種屬絲狀真菌的PCR反應(yīng)模板，與已報(bào)道的多個(gè)快速獲取方法作比較，同時(shí)以試劑盒抽提法作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增及結(jié)果分析。結(jié)果顯示，Chelex-100法獲取的模板進(jìn)行擴(kuò)增后雖然目的條帶明亮、清晰，但擴(kuò)增成功率較低(46.2%)，與李煥宇等[15]研究結(jié)果一致；機(jī)械破壁法擴(kuò)增成功率(69.2%)雖然高于Chelex-100法，但擴(kuò)增結(jié)果不理想；機(jī)械破壁聯(lián)合微波法獲取的模板效果良好，13株不同屬的絲狀真菌ITS序列均成功擴(kuò)增(擴(kuò)增成功率100%)，且條帶清晰明亮，PCR鑒定結(jié)果與試劑盒抽提法完全一致。

試劑盒抽提法是目前獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板最常用方法，但首先需對(duì)大量菌體進(jìn)行液氮研磨，提取過(guò)程約需1 h，提取費(fèi)時(shí)且成本高，不適合絲狀真菌的批量、快速鑒定。本研究建立的機(jī)械破壁聯(lián)合微波法僅需10 min即可獲得絲狀真菌用于PCR反應(yīng)的擴(kuò)增模板，效果與試劑盒抽提法相同，具備高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)。因此，機(jī)械破壁聯(lián)合微波法可快速高效獲取絲狀真菌PCR反應(yīng)模板，提高絲狀真菌PCR鑒定效率。