付魏萍， 袁 翊， 張祿滑

(1.內(nèi)江市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000；2.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000；3.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，四川 瀘州 646000)

碳青霉烯類(lèi)抗生素常常被認(rèn)為是治療超廣譜β內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染最為有效的藥物[1]。然而，由于該類(lèi)藥物的大量使用，碳青霉烯類(lèi)耐藥細(xì)菌也不斷出現(xiàn)，給全球公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅[1]。這些細(xì)菌能夠產(chǎn)生不同種類(lèi)的碳青霉烯酶，其中新德里金屬β內(nèi)酰胺酶(NDM)是新近發(fā)現(xiàn)的對(duì)臨床影響較大的一種酶。NDM-1是2008年在印度被首次發(fā)現(xiàn)的，之后便迅速蔓延全球[2]。到目前為止，已報(bào)道24種NDM突變體[3]。除單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素外，NDM能有效水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，包括碳青霉烯類(lèi)抗生素，給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[3]。NDM-5被首次報(bào)道是2011年，在1株多重耐藥的大腸埃希菌(Escherichiacoli)中檢測(cè)到[4]，和NDM-1相比，NDM-5中有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了替換(Val88Leu和Met154Leu)，這種替換使NDM-5有了更強(qiáng)的水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的能力[4]。目前，NDM-5已在多個(gè)細(xì)菌物種中被檢測(cè)到，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、變形桿菌等[3]。本研究從臨床病人血液標(biāo)本中分離到1株產(chǎn)NDM-5的大腸埃希菌，該菌株對(duì)多種抗菌藥物耐藥。結(jié)合高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)該菌株的基因組特征、耐藥質(zhì)粒特征進(jìn)行了分析，以期為臨床耐藥菌株感染的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 大腸埃希菌(Escherichiacoli)SCNJ06分離自一位急診科68歲男性發(fā)熱患者的血液標(biāo)本，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 ①胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)；②胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；③LB培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑 美羅培蘭、黏菌素和疊氮化鈉等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；2×TaqMaster Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 t100 PCR儀和GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Micro21R高速低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Vitek-2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 首先通過(guò)Vitek-2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)菌株SCNJ06做初步鑒定，再對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序鑒定。16S rRNA基因的擴(kuò)增及測(cè)序鑒定采用通用引物27F和1492R[5]。為了查明該菌株中碳青霉烯耐藥基因的存在情況，采用PCR方法對(duì)blaKPC、blaNDM、blaGES、blaMP、blaOXA-48和blaVIM耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)引物及方法參照文獻(xiàn)[5]。采用Vitek-2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)測(cè)定藥物敏感性，藥物包括頭孢吡肟、妥布霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢唑林、呋喃妥因、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星和頭孢他啶。美羅培南和黏菌素對(duì)該菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)通過(guò)微量肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定[6]。黏菌素的判斷點(diǎn)根據(jù)歐洲抗菌素敏感性試驗(yàn)委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行(http://www.eucast.org/)，其他藥物的判斷點(diǎn)根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行(CLSI，2019)。

1.2.2 接合試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]，采用肉湯進(jìn)行細(xì)菌接合，受體菌為大腸埃希菌J53(疊氮化物耐受)。接合轉(zhuǎn)化子涂于含有疊氮化鈉(150 μg/mL)和美羅培南(2 μg/mL)或阿米卡星(30 μg/mL)的LB平板進(jìn)行篩選。PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子中blaNDM或rmtB基因[8]。

1.2.3 基因組測(cè)序及分析 使用快速細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech, Shanghai, China)提取大腸埃希菌SCNJ06的總基因組DNA。純化的DNA送諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2000，測(cè)序方法為150 bp雙端測(cè)序，測(cè)序深度大約150×。使用Trimmomatic軟件去除Reads中接頭序列和低質(zhì)量序列[9]；使用SOAP denovo軟件組裝clean reads[10]；使用Prokka軟件注釋組裝序列[11]；使用ANI Calculator (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)分析基因組的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)以確定其物種歸屬。通過(guò)the center for genomic epidemiology (http://genomicepidemiology.org/)中的ResFinder 3.2檢測(cè)分析基因組中的耐藥基因。菌株的序列型使用MLST 2.0(Multi-Locus Sequence Typing)分析(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)，使用SerotypeFinder 2.0軟件(https://cge.cbs.dtu.dk/services/SerotypeFinder/)進(jìn)行血清分型；使用在線軟件PlasmidFinder 2.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)預(yù)測(cè)鑒定基因組中的質(zhì)粒?；蚪M中毒力基因的鑒定使用在線軟件VirulenceFinder 2.0預(yù)測(cè)(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)，進(jìn)化群的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]。從接合轉(zhuǎn)化子中提取攜帶blaNDM或rmtB基因的質(zhì)粒DNA，用相同的測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq測(cè)序。使用軟件SPAdes[13]過(guò)濾掉大腸埃希菌J53細(xì)菌基因組序列后，對(duì)剩余reads進(jìn)行拼接以獲得質(zhì)粒序列。質(zhì)粒復(fù)制子型通過(guò)軟件PlasmidFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)、MLST通過(guò)pMLST (https://cge.cbs.dtu.dk/services/pMLST/)進(jìn)行分析。使用Prokka軟件注釋質(zhì)粒序列，序列比對(duì)采用BLAST軟件。pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06質(zhì)粒全序列通過(guò)BRIG[14]進(jìn)行展示。

1.2.4 核苷酸序列接收號(hào) 本研究的細(xì)菌基因組序列和質(zhì)粒序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其中大腸埃希菌SCNJ06基因組序列接收號(hào)為WUBW00000000，pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06質(zhì)粒序列接收號(hào)分別為MN865121和MN865122。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌SCNJ06的藥物敏感性

經(jīng)Vitek-2 compact微生物分析系統(tǒng)檢測(cè)和16S rRNA基因測(cè)序鑒定表明，菌株SCNJ06為大腸埃希菌。Vitek-2 compact系統(tǒng)檢測(cè)顯示，SCNJ06對(duì)大多數(shù)測(cè)試藥物均表現(xiàn)為耐受，其中頭孢吡肟(MIC≥64 μg/mL)、妥布霉素(MIC≥16 μg/mL)、環(huán)丙沙星(MIC≥4 μg/mL)、氨曲南(MIC≥64 μg/mL)、哌拉西林-他唑巴坦(MIC≥128 μg/mL)、氨芐西林(MIC≥32 μg/mL)、氨芐西林/舒巴坦(MIC≥32 μg/mL)、阿米卡星(MIC≥64 μg/mL)、頭孢替坦(MIC≥64 μg/mL)、頭孢曲松(MIC≥64 μg/mL)、頭孢唑林(MIC≥64 μg/mL)、慶大霉素(MIC≥16 μg/mL)、亞胺培南(MIC≥16 μg/mL)、左氧氟沙星(MIC≥8 μg/mL)和頭孢他啶(MIC≥64 μg/mL)。但SCNJ06對(duì)呋喃妥因(MIC 64 μg/mL)表現(xiàn)為中介，對(duì)復(fù)方新諾明(MIC≤20 μg/mL)敏感。此外，微量肉湯稀釋法檢測(cè)顯示，該菌對(duì)美羅培南(MIC≥256 μg/mL)耐藥，對(duì)黏菌素(MIC≤2 μg/mL)敏感。

2.2 大腸埃希菌SCNJ06的基因組特征

大腸埃希菌SCNJ06的基因組草圖包含4 894 965 bp，其GC含量為50.72%。該基因組草圖組裝成了99個(gè)contig，其中大于1 000 bp的有90個(gè)。細(xì)菌基因組ANI分析進(jìn)一步證實(shí)了菌株SCNJ06屬于大腸埃希菌，因?yàn)榕c大腸埃希菌參考基因組K-12 substr. MG1655相比，該菌株基因組的OrthoANIu值達(dá)到了99.56%，而這一值要顯著高于判定一個(gè)細(xì)菌物種的臨界值95%～96%[15]。

經(jīng)ResFinder分析顯示，SCNJ06含有7種類(lèi)型的抗生素耐藥基因，包括氨基糖苷類(lèi)(rmtB、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id)、β內(nèi)酰胺類(lèi)(blaNDM-5、blaTEM-1B、blaCTX-M-55)、磷霉素類(lèi)(fosA3)、氯霉素類(lèi)(floR)、磺胺類(lèi)(sul2)、四環(huán)素類(lèi)(tet(A))和MLS類(lèi)(mdf(A))(大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可胺類(lèi)、鏈陽(yáng)性霉素B。經(jīng)PlasmidFinder分析顯示，SCNJ06中含有3種類(lèi)型質(zhì)粒IncFII、IncN和IncX3，進(jìn)一步分析顯示，該菌株序列型為ST167(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA等位號(hào)為10-11-4-8-8-13-2)，血清型為H9:O8。大腸埃希菌SCNJ06屬于進(jìn)化群A菌株，主要包括3種毒力因子，capU(Hexosyltransferase homolog)、gad(Glutamate decarboxylase)和iss(Increased serum survival)。

2.3 pNDM5_SCNJ06質(zhì)粒分析

接合試驗(yàn)顯示，blaNDM-5基因能夠從供體菌SCNJ06成功轉(zhuǎn)入受體菌J53中。與J53相比，美羅培南對(duì)blaNDM-5轉(zhuǎn)化子的MIC從0.5 μg/mL上升到了128 μg/mL。以上研究表明，blaNDM-5能夠正常發(fā)揮其功能，并且攜帶blaNDM-5的質(zhì)粒pNDM5_SCNJ06是一個(gè)可自發(fā)性接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。

pNDM5_SCNJ06長(zhǎng)度為46 161 bp，其GC含量為46.65%，包含58個(gè)開(kāi)放閱讀框(圖1)。ResFinder分析顯示，該質(zhì)粒僅含有1個(gè)耐藥基因blaNDM-5，其編碼產(chǎn)物NDM-5主要參與對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐受。PlasmidFinder分析顯示，該質(zhì)粒類(lèi)型為IncX3。通過(guò)將pNDM5_SCNJ06全序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒和最近報(bào)道的1個(gè)質(zhì)粒pNDM-5(GenBank接收號(hào)CP043333)完全匹配(100%的相似性和覆蓋率)。該質(zhì)粒來(lái)源于1株奇異變形桿菌，是從杭州的一個(gè)病人尿液中分離到的。此外，該質(zhì)粒和其他一些質(zhì)粒也有很高的相似性，例如pEC135(GenBank接收號(hào)MH347484，100%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質(zhì)粒來(lái)源于大腸埃希菌)和pNDM_MGR194(GenBank接收號(hào)KF220657，100%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質(zhì)粒來(lái)源于肺炎克雷伯菌)。

圖1 pNDM5_SCNJ06 與其他3 個(gè)類(lèi)似質(zhì)粒的比較Fig.1 Alignment of pNDM5_SCNJ06 with 3 other similar plasmids質(zhì)粒的比較分析使用 BRIG 軟件，pNDM5_SCNJ06 作為參考質(zhì)粒，最外環(huán)表示參考質(zhì)粒的注釋信息The alignment was performed using BRIG and pNDM5_SCNJ06 was used as a reference，the outer circle denotes annotation of the reference plasmid

2.4 prmtB_SCNJ06質(zhì)粒分析

接合試驗(yàn)表明，rmtB基因能夠從供體菌SCNJ06轉(zhuǎn)入受體菌J53。同時(shí)，藥敏試驗(yàn)顯示，與J53相比，rmtB轉(zhuǎn)化子對(duì)阿米卡星的敏感性發(fā)生了顯著的變化，從16 μg/mL變化為256 μg/mL。以上試驗(yàn)表明，prmtB_SCNJ06可自發(fā)性發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，同時(shí)rmtB基因能正常介導(dǎo)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥。

prmtB_SCNJ06質(zhì)粒包含89 602個(gè)核苷酸堿基對(duì)，其GC含量為53.38%，包含106個(gè)開(kāi)放閱讀框(圖2)。該質(zhì)粒類(lèi)型為IncFII，其序列型為F33∶A-∶B-，包含多個(gè)耐藥基因rmtB、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、blaTEM-1B、blaCTX-M-55、fosA3、floR、sul2和tet(A)。BLAST分析顯示，prmtB_SCNJ06和多個(gè)質(zhì)粒有較高的相似性和序列覆蓋率，如pSCKLB555-3(GenBank接收號(hào)CP043935，覆蓋率98%和相似性99.60%，該質(zhì)粒來(lái)源于肺炎克雷伯菌)、pHNZY32(GenBank接收號(hào)MG197502，覆蓋率98%和相似性99.95%)、pHNAH24(GenBank接收號(hào)MG197495，覆蓋率98%和相似性99.95%，來(lái)源于大腸埃希菌)和pEF02(GenBank接收號(hào)CP040807，覆蓋率98%和相似性99.61%，該質(zhì)粒來(lái)源于費(fèi)格森埃希菌)。

3 討 論

隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的廣泛使用，產(chǎn)NDM的腸桿菌科細(xì)菌也在大量產(chǎn)生，給全球公共衛(wèi)生安全造成了極大威脅[16-17]。然而，問(wèn)題還不僅如此，在攜帶blaNDM耐藥基因的同時(shí)，同一株菌還可能同時(shí)攜帶多種其他種類(lèi)的耐藥基因，從而對(duì)多種類(lèi)型抗菌藥物耐藥，使臨床可供選擇的治療方案變得更加局限。因此，開(kāi)展NDM流行病學(xué)調(diào)查對(duì)臨床感染的防控具有重要意義。本研究從臨床樣本中分離出1株碳青霉烯耐藥細(xì)菌，經(jīng)微生物分析系統(tǒng)檢測(cè)、16S rRNA基因測(cè)序以及基因組測(cè)序分析，均表明該菌株為大腸埃希菌。藥敏試驗(yàn)顯示，該菌株除對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，還對(duì)檢測(cè)的其他類(lèi)型抗菌藥物如頭孢類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)耐藥，但對(duì)黏菌素和復(fù)方新諾明敏感，表明該菌株為多重耐藥菌。再結(jié)合PCR檢測(cè)及測(cè)序分析，表明該菌株是一株產(chǎn)NDM-5的多重耐藥大腸埃希菌。

圖2 prmtB_SCNJ06 質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structure of plasmid prmtB_SCNJ06從內(nèi)向外顯示的是該質(zhì)粒的 GC 含量和 GC 偏移，最外環(huán)表示該質(zhì)粒的注釋信息GC content and GC skew are indicated from the inside out，the outer circle denotes annotation of the plasmid

SCNJ06含有11個(gè)耐藥基因，包括7種類(lèi)型，主要是氨基糖苷類(lèi)和β內(nèi)酰胺類(lèi)，各含有3個(gè)耐藥基因，剩余5個(gè)分別屬于磷霉素類(lèi)、氯霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和MLS類(lèi)。其中，耐藥基因譜與藥敏結(jié)果不一致主要有以下兩點(diǎn)：①藥敏結(jié)果顯示該菌對(duì)喹諾酮類(lèi)耐藥，但并沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因，可能原因是該菌具有其他的耐藥機(jī)制；②雖然檢測(cè)到磺胺類(lèi)耐藥基因sul2，但該菌對(duì)復(fù)方新諾明仍表現(xiàn)為敏感，表明該基因仍不足以抵抗該復(fù)方制劑的抑菌作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，11個(gè)耐藥基因中，除blaNDM-5位于質(zhì)粒pNDM5_SCNJ06上，MLS類(lèi)耐藥基因mdf(A)位于染色體上，其余9個(gè)均位于質(zhì)粒prmtB_SCNJ06上。以上結(jié)果表明，耐藥基因主要位于質(zhì)粒上，借助質(zhì)粒的可傳遞性，耐藥基因便很容易地傳播給其他細(xì)菌，引起更廣泛的耐藥。該菌株序列型為ST167，通過(guò)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)產(chǎn)NDM-5的ST167大腸埃希菌于近期相繼報(bào)道[18-20]，表明了該類(lèi)型菌株在國(guó)內(nèi)的廣泛流行性。

序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，blaNDM-5攜帶質(zhì)粒pNDM5_SCNJ06和國(guó)內(nèi)所報(bào)道的多個(gè)IncX3質(zhì)粒在序列上有高度的一致性，如分離自浙江的pNDM-5和pEC135，分離自山東的pNDM-QD28和pNDM-QD29。此外，該質(zhì)粒還與分離自其他國(guó)家的IncX3質(zhì)粒有高度一致性，如分離自印度的pNDM-MGR194，而pNDM-MGR194類(lèi)似質(zhì)粒在多國(guó)相繼被報(bào)道，如澳大利亞、丹麥等[18]。以上研究表明，pNDM-MGR194類(lèi)似質(zhì)粒具有世界流行性的特點(diǎn)，同時(shí)該類(lèi)型質(zhì)粒對(duì)blaNDM-5耐藥基因的傳播發(fā)揮著重要作用。prmtB_SCNJ06含有菌株SCNJ06大多數(shù)耐藥基因，與pNDM5_SCNJ06一起賦予該菌株更廣泛的耐藥譜。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，prmtB_SCNJ06和多個(gè)質(zhì)粒在序列上有高度的一致性，如pSCKLB555-3、pHNZY32、pHNAH24和pEF02，它們分離自不同的細(xì)菌，包括肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和費(fèi)格森埃希菌，表明該類(lèi)型質(zhì)?？梢钥缭椒N屬限制而自由傳播，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)這種類(lèi)型質(zhì)粒可以分離自不同的樣本，包括人和動(dòng)物，進(jìn)一步說(shuō)明了該類(lèi)型質(zhì)粒傳播的廣泛性。

本研究鑒定的ST167型多重耐藥大腸埃希菌SCNJ06，主要攜帶兩種自轉(zhuǎn)移性耐藥質(zhì)粒pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06，分別介導(dǎo)blaNDM-5和rmtB等多種耐藥基因的傳播。blaNDM與其他多種耐藥基因的共存與傳播給人類(lèi)健康造成了巨大威脅，有必要加大對(duì)該領(lǐng)域的流行病學(xué)調(diào)查，為臨床感染性疾病的綜合防控提供參考。