軒慧冬，黃顏眾，郭 娜，邢 邯

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所/國家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

大豆（Glycine max（L.）Merr.）通稱黃豆，古稱菽，在中國大豆種植的歷史大約有五千年，是世界公認大豆起源地。大豆在中國及世界各地均有栽培，世界各國的大豆是從中國通過不同途徑直接或間接傳播過去[1]。普遍公認的大豆傳播途徑是由中國在公元前三世紀傳入朝鮮，在六世紀傳至日本，約在三百年前傳入菲律賓與印度尼西亞，在十八世紀以后傳入歐美國家[2]。據(jù)相關(guān)記載，大豆在新石器時代被人類當作重要的糧食作物[3]。如今，大豆作為中國五大主要農(nóng)作物之一，是重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，而且用途也十分廣泛。大豆種子中具有大約40%的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[4]，其蛋白含量遠遠高于小麥、玉米、大米、牛肉和豬肉，可為人們提供主要的植物蛋白來源，有“田中之肉，營養(yǎng)之王”之稱。大豆種子中富含多種氨基酸和維生素等，可以為人們提供優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)。大豆常用來提取蛋白質(zhì)、榨取豆油、釀造醬油和做各種豆制品，同時，豆秸磨碎后可作家禽牲畜的飼料。大豆蛋白在非食品用途中的應(yīng)用也很多，如在制造塑料、膠黏劑、織物纖維和可食性包裝膜中等方面的應(yīng)用[5]。

1938年，中國的大豆總產(chǎn)量超過世界大豆總產(chǎn)量的90%[6]。1996年，中國的大豆進口量已經(jīng)超過出口量。據(jù)海關(guān)總署統(tǒng)計，2017年，中國進口大豆總量已經(jīng)達到9 552.6萬t，占全球大豆貿(mào)易量70%，成為全球第一大大豆進口國。2019年，中國大豆進口總量為8 551.1萬t，為歷史第二高峰。近年來，中國從國外進口的大豆均為轉(zhuǎn)基因大豆。目前，中國人口的數(shù)量不斷增加，人均可利用耕地卻逐年遞減，為滿足人們的糧食需求，國家需要在有限的可利用耕地上去種植更多的糧食作物，這使得大豆的種植面積逐漸減小。隨著全球經(jīng)濟飛速發(fā)展，環(huán)境生態(tài)問題愈發(fā)的嚴重，全球氣候逐漸變暖，使中國干旱與半干旱的地區(qū)發(fā)生干旱、高溫、鹽漬等逆境脅迫的概率越大頻率越高，嚴重影響中國大豆的生產(chǎn)，使得中國的大豆生產(chǎn)總量遠遠低于國民對大豆的整體需求。如果僅靠擴大規(guī)模生產(chǎn)大豆無法從根本上解決這種供需矛盾，而解決該問題的關(guān)鍵是必須通過育種手段來培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的大豆新品種[7]。傳統(tǒng)的大豆育種進程周期較長，工作量大，出現(xiàn)目標性性狀的概率低，但轉(zhuǎn)基因育種的出現(xiàn)可在很大程度上彌補傳統(tǒng)大豆育種存在的缺點，加快大豆育種的進程。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將目的DNA片段轉(zhuǎn)入特定受體生物中，使其與受體本身的基因組進行整合，再經(jīng)過數(shù)代的人工選擇，從而獲得具有穩(wěn)定遺傳目標性狀的個體。該技術(shù)的出現(xiàn)和利用使培育目標性狀新品種的速度更快效率更高。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物的發(fā)展史上，最早的轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)。在1987年出現(xiàn)了基因槍法，通過基因槍法Sanford將質(zhì)粒導(dǎo)入到植物的細胞，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻和洋蔥等[8]。1994年5月，美國孟山都公司培育的抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆首先獲準在美國商業(yè)化種植。中國在2008年啟動并實施了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項，加快了中國植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究步伐[9]。有報道從專利的角度比較了歐盟、美國、中國等國家和地區(qū)的轉(zhuǎn)基因大豆的申請狀況，發(fā)現(xiàn)歐盟和美國對大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)幾乎處于壟斷狀態(tài)，而中國申請的專利技術(shù)相對較少[10]。目前，中國轉(zhuǎn)基因大豆的育種研究正處于快速發(fā)展階段，已經(jīng)通過大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了較多提高大豆對非生物脅迫耐受性的候選材料，但仍沒有進入商業(yè)化生產(chǎn)階段。大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)在利用的過程中也會存在一些問題，如遺傳轉(zhuǎn)化效率低、假陽性率偏高等，但隨著大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，其優(yōu)勢不斷增強和其存在的問題也不斷被解決。面對日益嚴峻的環(huán)境條件和惡劣的土壤條件，使中國大豆耐逆育種面臨更大的挑戰(zhàn)。與傳統(tǒng)大豆育種方式相比，運用大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的高產(chǎn)、耐逆的大豆新品種具有周期更短目標性更強的優(yōu)勢，對保護生態(tài)環(huán)境、提高大豆產(chǎn)量和推動大豆育種具有重要的作用[11]。因此，對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高大豆對非生物脅迫耐受性的研究進行綜述對于大豆生物工程育種具有十分重要的意義。

1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的耐旱性

在全球氣候變暖和中國水資源短缺的背景下，中國干旱、半干旱地區(qū)發(fā)生干旱的強度和頻率增加，干旱災(zāi)害發(fā)生逐漸呈現(xiàn)出常態(tài)化[12]。同時，大豆屬于需水量較大的作物，干旱脅迫嚴重影響了中國大豆生產(chǎn)產(chǎn)量。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究培育耐旱的大豆品種具有重要的意義。轉(zhuǎn)基因技術(shù)對大豆耐旱性的提高，主要是通過利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一些轉(zhuǎn)錄因子與干旱脅迫相關(guān)的響應(yīng)蛋白表達來實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)一個新的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB84可以增強大豆的耐旱性，GmMYB84過表達的植株表現(xiàn)出更低的葉片失水率與相對含水量，高效的ROS的產(chǎn)生和清除效率和改變脅迫相關(guān)基因的表達來提高耐旱性[13]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)大豆GmNAC8轉(zhuǎn)錄因子與其互作蛋白大豆GmDi19蛋白可以正調(diào)控大豆的耐旱性[14]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在其他植物中發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以廣泛參與生物與非生物脅迫并起作用。Wei等研究發(fā)現(xiàn)在大豆中過表達GmWRKY57基因可以通過激活A(yù)BA與Ca2+信號通路中的基因來提高大豆的耐旱性[15]。DREBs屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子，與其靶基因啟動子區(qū)域的DRE元件特異性識別和結(jié)合，激活逆境響應(yīng)有關(guān)的靶基因表達提高植物抗逆性[16]。利用大豆穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的方法研究者將小麥中TaDREB3a基因?qū)氪蠖怪?，?jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)與對照相比表達TaDREB3a的轉(zhuǎn)基因大豆具有更高的耐旱性[17]。植物體內(nèi)的干旱響應(yīng)蛋白受干旱脅迫的誘導(dǎo)并與植物的耐旱性相關(guān)。Wang等研究人員鑒定了一個大豆干旱響應(yīng)蛋白GmRD22，該蛋白在干旱脅迫下可能調(diào)控細胞壁過氧化物酶進而增強細胞壁完整性，使GmRD22過表達植株表現(xiàn)出較強的耐旱性[18]。秦迪等分析轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因BADH轉(zhuǎn)基因大豆的抗旱性分析發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下過表達BADH基因的株系在萌發(fā)期的發(fā)芽指數(shù)比非轉(zhuǎn)基因大豆提高2.5%～16%，達到了顯著水平，苗期轉(zhuǎn)BADH基因的株系也表現(xiàn)更強的抗旱性[19]。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的耐鹽性

全球有近1/3的土地是鹽堿地，而我國的鹽漬土地面積占比較大，并且有約7%耕地土壤發(fā)生嚴重的鹽漬化[20]。大豆屬于中度耐鹽品種，高濃度鹽脅迫會使植株體內(nèi)積累過量的鹽離子進而降低大豆種子的發(fā)芽率嚴重時影響成熟期大豆的產(chǎn)量[21]。目前相關(guān)研究人員已克隆得到的相關(guān)耐鹽基因包括GmSIN1、GmNEK1、GmDREB6、GmGT-2B等，并驗證其在大豆耐鹽性方面的功能機制。大豆SALT INDUCED NAC1（GmSIN1）編碼受鹽脅迫誘導(dǎo)表達的大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子，在大豆中過表達GmSIN1通過促進根系的伸長提高大豆的耐鹽性，并且在鹽脅迫下過表達GmSIN1大豆與對照相比具有更高的產(chǎn)量和更優(yōu)良的農(nóng)藝性狀[22]，說明大豆GmSIN1基因是大豆耐鹽分子育種的優(yōu)良候選基因。有研究表明過表達大豆的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因GmNEK1可以促進轉(zhuǎn)基因植株的生長并且可以提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐鹽性[23]。將大豆GmDREB6轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)化到大豆中，發(fā)現(xiàn)過表達GmDREB6轉(zhuǎn)基因大豆與對照相比積累了更多的脯氨酸來提高對鹽脅迫的耐受性[24]。李冬梅等研究人員發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，GmGT-2B過表達轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比有更高的耐鹽性[25]。除了大豆內(nèi)源基因的表達可以可高耐鹽性，將其他植物的外源基因?qū)氲酱蠖贵w內(nèi)也可以增加大豆的耐鹽性。有研究發(fā)現(xiàn)在大豆中過表達桃自由基清除劑CuZnSOD編碼基因PpCuZnSOD可以顯著增加轉(zhuǎn)基因大豆植株的SOD活性水平來緩解鹽脅迫對大豆的氧化損傷，進而提高大豆的耐鹽性[26]。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的耐熱性

近50年來全球溫度升高速率呈近線性趨勢增加，約是過去100年的2倍[27]。最適大豆發(fā)芽和成熟期的生長溫度為15～22℃、開花期為20～25℃，當環(huán)境溫度高于28℃時能影響大豆的正常生長發(fā)育進程，溫度的不斷增加會對大豆產(chǎn)生熱脅迫。高溫脅迫影響大豆的光合作用、呼吸作用和蒸騰作用等，進而影響大豆籽粒的生長發(fā)育嚴重時甚至?xí)?dǎo)致大豆產(chǎn)量急劇降低[28]。目前，通過轉(zhuǎn)錄組測序等方法，已鑒定了一些與大豆高溫脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白。吳廣錫等將大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子GmHsFA1基因構(gòu)建到植物的表達載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmHsFA1基因?qū)敫弋a(chǎn)品種黑農(nóng)53中，對GmHsFA1過表達植株進行高溫脅迫處理，發(fā)現(xiàn)GmHsFA1過表達植株的耐熱性比受體黑農(nóng)53大豆品種有顯著高[29]。在高溫條件下，植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)會發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化甚至變性，而熱激蛋白可被熱脅迫誘導(dǎo)表達，幫助植物體內(nèi)的部分蛋白恢復(fù)其原有的空間構(gòu)象或生物活性，使相關(guān)蛋白在高溫條件下維持正常功能。戎潔等從大豆JN18品種中克隆出了小熱激蛋白基因HSP17.4，將其轉(zhuǎn)化到受體大豆JN18中，對獲得單拷貝的GmHSP17.4過表達轉(zhuǎn)基因株系與受體進行耐熱性鑒定發(fā)現(xiàn)與大豆JN18相比GmHSP17.4過表達轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性更強[30]。本實驗室研究表明與對照大豆品種天隆一號相比，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將大豆GmHsp90A2基因?qū)氪蠖蛊贩N天隆一號產(chǎn)生的過表達GmHsp90A2轉(zhuǎn)基因大豆株系具有較強的耐熱性，相反利用Crispr/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的GmHsp90A2敲除突變體的耐熱性較差[31]，表明大豆GmHsp90A2正調(diào)控大豆的耐熱性，是大豆耐熱性育種的有力候選基因。

4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的雙重耐逆性

在大豆的生長過程中，除了遭受單一的逆境脅迫，很多時候會發(fā)生混合脅迫，例如干旱與鹽脅迫、干旱與熱脅迫等。目前，大豆中已經(jīng)鑒定到一些提高雙重逆境脅迫的脅迫應(yīng)答基因，如bZIP轉(zhuǎn)錄因子，WRKY轉(zhuǎn)錄因子、晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白，熱激響應(yīng)因子等。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物的生長發(fā)育和各種逆境脅迫過程。李媛媛等研究人員對大豆bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族A亞族成員GmFDL06基因的過表達轉(zhuǎn)基因株系與受體大豆品種東農(nóng)50進行抗旱和耐鹽性的鑒定發(fā)現(xiàn)，GmFDL06基因的過表達轉(zhuǎn)基因株系與受體品種相比有更高的相對植株高度和干物質(zhì)量以及更強的抗旱和耐鹽性[32]。將大豆WRKY轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY12轉(zhuǎn)入到大豆Williams 82獲得過表達轉(zhuǎn)基因株系，將過表達GmWRKY12轉(zhuǎn)基因株系與Williams 82進行干旱和鹽脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達GmWRKY12轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性與耐鹽性比Williams 82更強[33]。有研究報道了一個新的晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白GmSYP24基因參與ABA信號通路，將GmSYP24基因在大豆中進行過表達獲得GmSYP24過表達轉(zhuǎn)基因株系并對其進行耐旱與耐鹽性鑒定，表明GmSYP24過表達轉(zhuǎn)基因株系比對照有更強的耐旱與耐鹽性[34]。李秀英等在鹽和干旱脅迫下對3個轉(zhuǎn)BADH基因大豆株系和非轉(zhuǎn)基因受體吉農(nóng)17的發(fā)芽、植株生長及主要農(nóng)藝性狀進行了鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)BADH基因大豆株系較非轉(zhuǎn)基因大豆的抗旱性、耐鹽性明顯提高，但是二者的主要農(nóng)藝性狀間沒有明顯差異[35]。吳廣錫等研究人員對轉(zhuǎn)GmHsFA1基因的過表達株系進行耐熱和抗旱性的綜合鑒定，結(jié)果表明與對照相比，大豆GmHsFA1過表達株系的耐熱和抗旱能力有更大的提高[24]。

5 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的其他耐逆性

大豆的生長過程中除了出現(xiàn)上述的逆境脅迫外，還可能遭受土壤的低氮、鋁離子脅迫等。為適應(yīng)這些脅迫，大豆可以通過調(diào)控相關(guān)脅迫誘導(dǎo)蛋白的表達來減弱逆境脅迫的損傷。在大豆生長發(fā)育過程中，氮素是必不可少的元素之一[36]。徐偉等研究發(fā)現(xiàn)在低氮脅迫下過表達細胞自噬過程相關(guān)基因GmATG8c轉(zhuǎn)基因大豆株系與受體大豆品種相比，過表達GmATG8c的轉(zhuǎn)基因大豆株系的低氮耐受性和單株產(chǎn)量均顯著高于受體大豆品種，說明GmATG8c基因是具有提高氮素利用效率的一個有力候選基因[37]。全球可用耕地的40%為酸性土壤，如果酸性土壤的pH＜5.5時，土壤中的鋁會以Al3+形式存在，會對大豆產(chǎn)生鋁離子脅迫進而抑制大豆的生長發(fā)育。李莎通過發(fā)根農(nóng)桿菌大豆轉(zhuǎn)化方法研究檸檬酸轉(zhuǎn)運體家族的GmAACT1和GmALF5基因在耐鋁脅迫中的功能，研究發(fā)現(xiàn)過表達GmAACT1和GmALF5基因?qū)Υ蠖笰l3+脅迫有一定程度的緩解作用[38]。大豆屬于喜磷農(nóng)作物，磷元素不僅是大豆遺傳物質(zhì)的重要組成元素也廣泛參與大豆體內(nèi)的酶促反應(yīng)和新陳代謝過程[39]。在我國有大約2/3的耕地處于缺磷狀態(tài)并且土壤中有效磷含量較少[40]，磷元素的短缺嚴重制約了大豆的生長發(fā)育及產(chǎn)量。有研究發(fā)現(xiàn)將水稻中磷轉(zhuǎn)運體OsPT2和OsPT6穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到大豆中，與對照相比過表達OsPT2和OsPT6的轉(zhuǎn)基因株系低磷耐受性有所提高[41]。

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究的飛速發(fā)展，科研人員已經(jīng)鑒定到許多大豆非生物脅迫相關(guān)的功能基因。同時，我國的大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展水平處于世界前沿水平，可以準確快速有效的對已經(jīng)鑒定到的非生物脅迫基因進行功能的鑒定。對于日漸嚴峻的環(huán)境條件對我國大豆生長造成的影響，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以準確快速的提高大豆對非生物脅迫的耐受性，如耐旱性、耐鹽性、耐熱性、低氮耐受性等，保證大豆處于逆境脅迫條件時盡可能減少對大豆產(chǎn)量的損失。但是，關(guān)于轉(zhuǎn)基因大豆的相關(guān)耐逆性研究只是處于實驗室研究、轉(zhuǎn)基因安全中間試驗和環(huán)境釋放階段，還沒有進行大面積推廣和用于商業(yè)化生產(chǎn)[42]。目前，我國已經(jīng)建立了轉(zhuǎn)基因安全評價和檢測體系，逐步優(yōu)化的轉(zhuǎn)基因大豆穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，已有許多獲得我國自主知識產(chǎn)權(quán)的基因和具有潛在應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因材料。依據(jù)我國大豆生產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境，相信不久的將來我國轉(zhuǎn)基因大豆可以實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，提高大豆在逆境脅迫下的產(chǎn)量，對我國大豆耐逆育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。