唐詠文，崔同濤，王 敏 ，郭 濤，許玲玲 ，劉 津，譚 寧

（1.廣東省心血管病研究所成人超聲科廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510120）

隨著社會(huì)人口老齡化，心肌梗死（myocardial infarction，MI）的發(fā)病率逐年升高。血管急性閉塞不僅導(dǎo)致心肌丟失，還會(huì)使心室重構(gòu)導(dǎo)致慢性心力衰竭［1］。盡早開通血管恢復(fù)灌注可以減輕心肌壞死、重構(gòu)并改善預(yù)后［2］。心肌組織再灌注后出現(xiàn)心肌損傷及功能惡化，誘發(fā)心肌細(xì)胞壞死和凋亡加重［3-4］，即缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。心律失常，特別是復(fù)雜室性心律失常包括頻發(fā)室性期前收縮、室性心動(dòng)過(guò)速是再灌注損傷的常見表現(xiàn)，且與心功能關(guān)系密切［5-6］。研究再灌注損傷致心律失常的特征和轉(zhuǎn)歸影響，對(duì)臨床工作有指導(dǎo)意義。臨床中發(fā)現(xiàn)急性MI 患者延遲再灌注后心功能改善不明顯，甚至出現(xiàn)病情惡化［7］。了解心律失常如何影響再灌注損傷可以幫助進(jìn)一步認(rèn)識(shí)延遲再灌注心肌損傷。動(dòng)物心肌IRI 模型建立方法包括體內(nèi)原位冠狀動(dòng)脈結(jié)扎或Langendorff 離體心臟缺血再灌注方法［8］。我們通過(guò)原位結(jié)扎法觀察大鼠心肌再灌注時(shí)心律失常與左心室功能變化及細(xì)胞凋亡改變，探討心律失常對(duì)再灌注損傷左心室功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取 7～8 周 齡 、體 質(zhì) 量 180～220 g 雄 性 SD（Sprague Dawley）大鼠［許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034］，按隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組，每組至少12 只。操作遵守國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利實(shí)驗(yàn)指南。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批，編號(hào)：［GDREC2014016H（R1）］，且在中山醫(yī)科大學(xué)無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成（登記號(hào)：2016-218DS）。

1.2 分組及干預(yù)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為大鼠原位心臟前降支血管結(jié)扎及釋放術(shù)。大鼠分為對(duì)照組、MI再灌注組和延遲再灌注組（n≥12）。對(duì)照組為假手術(shù)，前降支下僅穿線無(wú)結(jié)扎；MI再灌組（缺血1 h后再灌注，A組）為前降支結(jié)扎60 min 后釋放復(fù)灌注；延遲再灌注組（缺血4 h后再灌注，B 組）為結(jié)扎4 h 后釋放復(fù)灌注。觀察并記錄復(fù)灌注后大鼠心肌顏色、心電圖改變；術(shù)后24 h和3 d分別記錄大鼠心電圖及心律失常。復(fù)雜室性心律失常（complex ventricular arrhythmias，CVTA）指頻發(fā)室性期前收縮或短陣室性心動(dòng)過(guò)速［9］。術(shù)后72 h 行超聲評(píng)估左心室功能變化；Masson′s 染色評(píng)估MI 區(qū)域形態(tài)及TUNEL 染色檢測(cè)心肌凋亡。

1.3 缺血再灌注模型建立

SD 鼠3 d 適應(yīng)期后禁食過(guò)夜，術(shù)前稱體質(zhì)量。10%水合氯醛以0.35 mL/100 g 劑量經(jīng)腹腔給藥麻醉大鼠后以18G 留置針經(jīng)口腔行氣管插管接呼吸機(jī)。大鼠四肢連接心電圖機(jī)導(dǎo)聯(lián)，于胸骨旁0.5 cm 處第3 至5 肋間切開皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織、肌肉［10］。將小棉團(tuán)放在左心耳下幫助暴露左前降支（left descending artery，LAD）。以6-0 帶針眼科無(wú)損縫線于肺動(dòng)脈圓錐根部進(jìn)針，于左心耳下 2～3 mm 處出針過(guò)線，針寬 2～3 mm，深0.5～1.0 mm。輕提縫線如見前壁心肌顏色變淡，可初步判斷結(jié)扎有效。放置一段（5 mm）橡皮PE段于結(jié)扎處心臟表面，在橡皮PE 段上打結(jié)。前壁心肌呈蒼白色及肢Ⅱ?qū)?lián)ST 段弓背抬高1 mm 以上提示缺血成功。復(fù)灌30 s 后通過(guò)觀察前壁心肌顏色恢復(fù)及心電圖ST段回落判斷再灌注成功。

1.4 M 型超聲檢測(cè)左心形態(tài)及功能

建模72 h 后大鼠在乙醚麻醉下行M 型超聲檢測(cè)。在左心室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）和左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）；四腔心切面計(jì)算左心室舒張末期容量（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容量（left ventricular end-systolic volume，LVESV）；Simpson′s 法計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、每搏射血量（stroke shot，SS）和心排血出量（cardiac output，CO）。檢測(cè)由專業(yè)超聲技師在Visual Sonics Vevo2100 動(dòng)物超聲機(jī)上完成。

1.5 心肌組織學(xué)染色和TTUUNNEELL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

再灌注后 72 h 行 Masson′s 染色及 TUNEL 染色反映各組心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡改變。取結(jié)扎點(diǎn)下2 mm 處心肌組織于4%多聚甲醛固定，酒精脫水后石蠟包埋并切片。行Masson′s染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。采用改進(jìn)的TUNEL方法［11］，石蠟包埋切片預(yù)處理、脫蠟后多聚甲醛固定；2 mg/mL的蛋白酶K溶液通透樣本；加入450 μL熒光素片段末端標(biāo)記反應(yīng)混合物以及50 μL TdT酶行標(biāo)記反應(yīng)，封片并熒光激發(fā)。在綠色熒光濾片下觀察被標(biāo)記的紅色熒光凋亡細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料經(jīng)Levene′s 檢驗(yàn)為正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析（one-way ANOVA）；組內(nèi)多重比較用最小意義差異檢驗(yàn)LSD法或Dummetts（方差不齊時(shí)）。計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，組間比較用卡方（χ2）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠左心室功能超聲指標(biāo)比較

再灌注A 組和延遲再灌注B 組大鼠SS、LVEF、LVFS 和CO 較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。再灌注A 組和延遲再灌注B組大鼠LVESV 呈增加趨勢(shì)，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LSD 法分析結(jié)果顯示，延遲再灌注B 組較對(duì)照組大鼠LVESD 明顯增加（f=1.0，P=0.038）；延遲再灌注B 組較對(duì)照組大鼠 LVESV 明顯增加（f=46.40，P=0.03）；SS、LVEF 和 LVFS 均明顯下降（f=33.70，P=0.02；f=21.53，P=0.003；f=14.67，P=0.002），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注A 組較對(duì)照組大鼠SS、LVEF 和LVFS 均明顯下降（f=25.71，P=0.02；f=14.21，P=0.04；f=8.71，P=0.04）；再灌注A 組和延遲再灌注 B 組大鼠 SS、LVEF 和 LVFS 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（f=7.98，P=0.33）。再灌注A組及延遲再灌注B 組大鼠CO 較對(duì)照組均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A 組vs.對(duì)照組：f=8.93，P=0.01；B 組vs.對(duì)照組：f=11.92，P=0.001）。再灌注 A 組和延遲再灌注B 組大鼠心率、體質(zhì)量及LVEDD 及LVEDV比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 再灌注后發(fā)生CCVVTTAA 亞組和無(wú)CCVVTTAA 亞組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較

延遲再灌注B 組大鼠再灌注后心律失常發(fā)生率為67%（8/12），其中 1 例為心房顫動(dòng)，1 例為偶發(fā)房性期前收縮；50%（6/12）例表現(xiàn)為室性期前收縮二聯(lián)律或短陣室性心動(dòng)過(guò)速。再灌注A 組大鼠中發(fā)現(xiàn)3 例短陣室性心動(dòng)過(guò)速、1 例頻發(fā)室性期前收縮二聯(lián)律及2 例房性期前收縮。再灌注A 組大鼠CVTA 發(fā)生率為 33%（4/12），延遲再灌注B 組大鼠CVTA 發(fā)生率為50%（6/12），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.69，P=0.41）。再灌注發(fā)生CVTA亞組和無(wú)CVTA 亞組大鼠體質(zhì)量、心率、LVEDD 和LVEDV 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠心臟收縮功能明顯下降，包括 LVESD 和 LVESV 增大，SS、LVEF、LVFS 和 CO 下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 再灌注后及延遲再灌注后發(fā)生CCVVTTAA 亞組和無(wú)CCVVTTAA 亞組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較

與再灌注后無(wú)CVTA 亞組大鼠比較，再灌注后發(fā)生CVTA 亞組大鼠的LVESD（f=-4.57，P=0.001，圖1A）、LVESV（f=-4.12，P=0.002，圖1C）、LVEDD（f=-2.75，P=0.02，圖1B）和LVEDV（f=-2.76，P=0.02，圖1D）增大；SS（f=2.51，P=0.04，圖1E）、LVEF（f=5.62，P＜0.001，圖1F）、LVFS（f=5.08，P=0.001，圖1G）、CO（f=2.61，P=0.03，圖1H）下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3 組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較 ［n=12，±s］

表1 3 組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較 ［n=12，±s］

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與再灌注組A 組比較，1）*P＜0.05

檢測(cè)指標(biāo)體質(zhì)量（g）心率（次/min）LVESD（mm）LVEDD（mm）LVESV（μL）LVEDV（μL）SS（μL）LVEF（%）LVFS（%）CO（mL/min）對(duì)照組253.50±21.24 382.60±52.50 3.77±0.90 5.91±0.80 65.36±28.39 171.25±38.93 112.33±27.94 64.98±11.52 36.97±9.48 41.87±6.05再灌注組A 組272.25±40.69 379.40±28.21 4.22±0.90 5.82±0.62 84.63±37.50 177.36±49.25 86.62±17.56*52.77±13.97*28.26±9.40*32.95±7.47*延遲再灌注組B 組258.33±32.60 384.07±27.57 4.88±0.94*5.94±0.69 111.75±48.21*180.20±44.46 78.64±17.39*43.45±12.741）*22.31±7.651）*29.91±5.681）*F 值0.77 0.06 2.59 0.45 2.87 0.55 5.87 5.54 5.68 6.78 P 值0.47 0.94 0.09 0.64 0.07 0.58 0.008 0.01 0.009 0.004

表2 再灌注后發(fā)生CVTA 亞組和無(wú)CVTA 亞組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較 ［±s］

表2 再灌注后發(fā)生CVTA 亞組和無(wú)CVTA 亞組大鼠左心室超聲指標(biāo)比較 ［±s］

檢測(cè)指標(biāo)n體質(zhì)量（g）心率（次/min）LVESD（mm）LVEDD（mm）LVESV（μL）LVEDV（μL）SS（μL）LVEF（%）LVFS（%）CO（mL/min）再灌注無(wú)CVTA 組14 264.71±40.13 385.62±24.08 4.05±0.93 5.74±0.76 77.63±43.08 166.45±49.26 88.82±20.41 55.65±12.78 30.02±8.51 34.05±7.49再灌注發(fā)生CVTA 亞組10 266.10±33.54 376.29±31.97 5.12±0.53 6.28±0.39 126.97±28.14 200.94±27.20 73.97±6.67 37.55±68.14 18.65±3.84 27.76±2.68 F 值-0.09 0.82-3.27-2.06-3.16-2.0 2.21 4.07 3.93 2.90 P 值0.93 0.42 0.004 0.051 0.005 0.058 0.038＜0.001 0.001 0.01

與延遲再灌注無(wú)CVTA 亞組大鼠比較，延遲再灌注發(fā)生 CVTA 亞組大鼠 LVEF（f=2.76，P=0.04，圖1F）、LVFS（f=3.79，P=0.03，圖1G）減少，LVESV（f=-2.22，P=0.02，圖1C）增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩亞組大鼠SS（f=1.05，P=0.32，圖1E）、CO（f=1.20，P=0.26，圖1H）、LVESD（f=-1.36，P=0.21，圖1A）、LVEDD（f=-0.87，P=0.41，圖1B）、LVEDV（f=-0.79，P=0.45，圖1D）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 形態(tài)學(xué)染色及凋亡染色結(jié)果分析

如圖2A 所示，Masson′s 染色可見再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌纖維斷裂范圍均較大；同時(shí)心肌纖維化程度更加明顯，心肌細(xì)胞明顯萎縮，而心室肌層無(wú)明顯變薄。圖2B 中TUNEL 染色顯示綠染的心肌凋亡細(xì)胞核占比在再灌注發(fā)生CVTA 亞組大鼠中均較再灌注無(wú)CVTA 組大鼠增多，提示發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌細(xì)胞丟失更多。在延遲再灌注組有更多心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)左心功能影響更明顯。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再灌注后室性心律失常在延遲再灌注組大鼠的發(fā)生率約為延遲再灌注組大鼠的1.4 倍。CVTA 在再灌注即刻至再灌注后數(shù)天均可觀察到。無(wú)論是在再灌注組或延遲再灌注組，大鼠發(fā)生室性心律失常對(duì)其LVESV、LVEF 和LVFS 均有明顯的負(fù)性影響。根據(jù)既往對(duì)4 400 例MI 行再灌注治療的患者報(bào)道，再灌注損傷伴室性心律失常可高達(dá)20%～25%，其中室性心動(dòng)過(guò)速最為常見，約占所有心律失常的35%，且無(wú)論再灌注時(shí)抑或晚期室性心律失常均增加患者院內(nèi)及院外3～5 倍死亡風(fēng)險(xiǎn)［5］。同期有研究采用心臟核磁共振（CMR）方法評(píng)估損傷心肌，提示延遲再灌注下的心肌受損更嚴(yán)重，表現(xiàn)為心肌壞死面積增大和血管微循環(huán)阻力增加［12］。

心肌細(xì)胞再灌注后細(xì)胞線粒體內(nèi)過(guò)氧自由基釋放及細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力減弱；細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化作用導(dǎo)致其通透性增加并影響細(xì)胞功能［13-14］。鈣超載后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞早后除極，心肌細(xì)胞自律性降低，誘導(dǎo)心律失常發(fā)生［15］。同時(shí)過(guò)氧自由基產(chǎn)生后可激活線粒體K+（ATP）通道過(guò)多開放，影響線粒體膜電位［16-17］，同時(shí)也可激發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑致心肌細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，心臟Masson′s 染色提示再灌注后發(fā)生室性心律失常亞組大鼠的纖維化程度更加明顯，心肌細(xì)胞萎縮也更加明顯。而TUNEL 染色也提示發(fā)生CVTA 亞組大鼠心肌細(xì)胞核凋亡比例均較再灌后無(wú)CVTA 亞組大鼠增多；結(jié)合超聲結(jié)果可發(fā)現(xiàn)其顯著影響左心室的收縮功能，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF、LVFS 下降且 LVESV 變大。

再灌注損傷的干預(yù)可以采用缺血預(yù)處理［18］（ischemic preconditioning，IP）和遠(yuǎn)端預(yù)處理［19］（remote post-conditioning）方法進(jìn)行預(yù)防?；A(chǔ)研究提示遠(yuǎn)端肢體IP 通過(guò)影響心肌K+（ATP）通道有效保護(hù)心臟收縮功能，并可有效減少再灌注后心律失常發(fā)生［20］。同樣在臨床中，首次醫(yī)療接觸后給予急性胸痛患者外周動(dòng)脈IP，可以有效減少介入治療中心臟靶血管無(wú)復(fù)流的發(fā)生率［19］。同樣冠狀動(dòng)脈缺血后處理（ischemic post-conditioning）可以通過(guò)對(duì)靶血管多次短暫的開通和阻斷操作實(shí)現(xiàn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可明顯降低室性心律失常持續(xù)時(shí)間，是減少再灌注后心肌損傷和改善預(yù)后的一種治療策略［21］。同時(shí)聯(lián)合新型的抗血小板藥物和抗凝劑，也可以大約降低35%～50%心肌最終受損面積?？寡踝杂苫幬锶巛o酶Q10 可以通過(guò)改善心肌細(xì)胞能量代謝；鈣通道阻滯劑可以通過(guò)降低鈣超載的直接心肌損害和通過(guò)降低后負(fù)荷，增加CO 改善MI 后心律失常和改善后續(xù)可能的心力衰竭［20］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，提示再灌注后發(fā)生CVTA 可以顯著影響左心室收縮功能；特別是在延遲缺血再灌注條件下，室性心律失常對(duì)左心室功能影響更加明顯。

總之，MI 再灌注后發(fā)生CVTA 可致左心室收縮功能進(jìn)一步下降；同時(shí)伴有更加明顯的心肌細(xì)胞萎縮、細(xì)胞凋亡和組織纖維化。