冉 昕，趙德剛,2＊

(1. 貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州特色植物資源保育工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550006)

杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）是我國(guó)二級(jí)珍稀保護(hù)樹(shù)種，是單科單屬單種的多年生落葉喬木，分布于我國(guó)的熱帶至暖溫帶地區(qū)，有27個(gè)省廣泛種植[1]。杜仲既是重要的藥用植物，也是優(yōu)質(zhì)的膠源植物，在其葉片、果皮、樹(shù)皮和根皮中均有白色杜仲膠絲[2-3]。杜仲膠與天然橡膠（產(chǎn)自巴西橡膠樹(shù)）均為聚異戊二烯，二者互為同分異構(gòu)體，天然橡膠為順式聚異戊二烯（cis-polyisoprene），杜仲膠為反式聚異戊二烯（trans-polyisoprene）。與順式橡膠相比，反式杜仲膠的絕緣性更高，熱脹冷縮系數(shù)更低，酸堿耐受性更強(qiáng)，并具有形狀記憶功能和獨(dú)特的“橡膠-塑料”二重性[4-6]。

橡膠基本單元為異戊烯基焦磷酸（IPP）。在三葉橡膠中，異戊稀基焦磷酸通過(guò)細(xì)胞中的甲瓦龍酸（MVA）途徑產(chǎn)生，在杜仲實(shí)生葉片含膠細(xì)胞中，IPP通過(guò)MVA和甲基赤磷酸（MEP）2種途徑產(chǎn)生[7]。IPP通過(guò)2種途徑產(chǎn)出后，在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶作用下部分轉(zhuǎn)化為其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP），這2種物質(zhì)通過(guò)一系列異戊烯基焦磷酸合酶，包括牻牛兒基焦磷酸合酶（GPPS）、法尼基焦磷酸合酶（FPPS）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）合成相應(yīng)的牻牛兒基焦磷酸、法尼基焦磷酸、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸，最后在橡膠延長(zhǎng)因子（Rubber Elongation Factor,REF）、小橡膠顆粒蛋白（SRPP）、橡膠轉(zhuǎn)移酶(RT)等作用下合成長(zhǎng)鏈橡膠[6]。杜仲中的反式聚異戊二烯分子，由多個(gè)反式單元的二甲基烯丙基和末端脂肪族脂肪酸的酯基或二磷酸基排列組成[8]。

在長(zhǎng)鏈橡膠的生物合成過(guò)程中，橡膠延長(zhǎng)因子（Rubber Elongation Factor,REF）發(fā)揮重要功能并受到廣泛關(guān)注。1989年，Dennis等從三葉橡膠樹(shù)中分離出一種分子量為14 KD的膠粒蛋白（HbREF），制備了特異性免疫球蛋白IgG抗體，或用絲氨酸蛋白胰蛋白酶（serine protease trypsin）處理該蛋白后，在體外均很大程度抑制了橡膠的生物合成，被稱(chēng)為橡膠延長(zhǎng)因子[9]。之后，Attanyaka等獲得了編碼HbREF蛋白的cDNA序列，編碼的蛋白可以與橡膠粒子緊密結(jié)合，是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶將異戊二烯單元添加到橡膠分子中不可缺少的成分[10]。此后不久，Cornish等發(fā)現(xiàn)，橡膠延長(zhǎng)因子在橡膠粒子的聚合中起到控制作用[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，除根組織外，三葉橡膠樹(shù)的乳膠細(xì)胞、皮、葉中均檢測(cè)到HbREF mRNA轉(zhuǎn)錄本，但組織間表達(dá)水平不同，通過(guò)對(duì)產(chǎn)膠量不同的無(wú)性系橡膠樹(shù)HbREF的表達(dá)水平比較分析，發(fā)現(xiàn)HbREF基因表達(dá)模式與乳膠產(chǎn)量呈正相關(guān)[12]。本項(xiàng)目組通過(guò)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合RACE技術(shù)擴(kuò)增得到全長(zhǎng)1 075 bp的序列，分析比對(duì)后命名為EuREF1[13]，Wuyun等將該基因命名為EuSRPP1[14]。但EuREF對(duì)杜仲對(duì)橡膠積累及膠分子延長(zhǎng)的關(guān)系和作用尚不明確，本論文初步分析了EuREF1基因在不同器官組織中的表達(dá)水平與橡膠積累和橡膠分子量的關(guān)系，試圖探明EuREF1與膠分子量和含膠率的關(guān)系，進(jìn)一步深入探究杜仲膠合成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料取自貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院試驗(yàn)示范基地，16年生杜仲樹(shù)。選擇典型樣株雌、雄株各3株，從2019年4月15日開(kāi)始，每15 d取樣1次，至6月15日共5次。每株選擇樹(shù)冠中部外圍當(dāng)年生新梢同時(shí)期生長(zhǎng)的葉片、莖皮和當(dāng)年生果進(jìn)行采摘，用自封袋封上后放于液氮中保存防止RNA降解，帶回室內(nèi)并保存于-80℃，用于mRNA提取和RT-PCR分析以及杜仲膠提取分析。

1.2 方法

1.2.1 杜仲膠提取與含量計(jì)算 參照Spence等的方法[15]，將不同時(shí)期采摘葉片、莖皮和果皮分別用電子天平（北京丹佛儀器有限公司）稱(chēng)取10 g樣品，電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）中120℃ 30 min，溫度調(diào)至80℃，烘至恒質(zhì)量，稱(chēng)取烘干后的樣品質(zhì)量，精確至小數(shù)點(diǎn)后3位，將方法中溶劑苯替換為石油醚（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，沸程60～90℃）。對(duì)杜仲膠進(jìn)行提取獲得精膠。橡膠含量=精膠/組織干質(zhì)量×100%。

1.2.2 RT-PCR分析 根據(jù)康為世紀(jì)公司的Plant RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取杜仲葉、莖皮、雌果中的總RNA，并利用Reverse Transcriptase MMLV試劑盒（TAKARA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)的EuREF1基因qPCR引物為，F(xiàn)：5′-CGCACATTGGTCGGAGAACTACAAC-3′；R：5′-GCAAAATAAGCAGCCGCCTCTAGTC -3′，以杜仲EuActin基因?yàn)閮?nèi)參基因[16]，以cDNA為模板，采用RT-PCR試劑盒（Novoprotein）對(duì)EuREF1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析（BIO-RAD）。反應(yīng)體系Primer F/R各0.2 μL，cDNA 1 μL，Premix Mix 5 μL，ddH2O 3.6 μL，共10 μl，做3次重復(fù)。

1.2.3 杜仲膠分子量檢測(cè) 杜仲膠烘干后，按照1 mg·mL-1用四氫呋喃（Merck）溶解，置于28℃搖床（Thermo）溶解3 h，用0.22 μm的有機(jī)濾頭過(guò)濾溶液；裝入安捷倫排阻色譜儀（1 260 Infinity II）配套小棕瓶中進(jìn)行檢測(cè)；流動(dòng)相：四氫呋喃；樣品注入量: 35 μL（1 mg·mL-1）；柱溫箱：40℃。得到的圖譜再用GPC/SEC（gel permeation chromatography/Size-exclusion chromatography）配套軟件直接處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲不同組織的橡膠積累變化

2.1.1 杜仲葉片含膠量變化 在初春杜仲新芽長(zhǎng)出以后，于4月15日開(kāi)始至6月15日，每15 d采摘1次葉片測(cè)定含膠量。結(jié)果表明：從4月15日至6月15日，雌、雄株葉片中杜仲膠含量均不斷增加；在4月15日，雌、雄株葉片含膠量分別為0.51%和0.33%，二者差異不顯著；5月2日，雌、雄株葉片含膠量分別為0.84%和0.36%，雌株葉片含膠量顯著高于雄株葉片；到5月15日，雌、雄株葉片含膠量分別為0.89%和0.76%，二者差異不顯著；6月2日，雌、雄株葉片含膠量分別為0.95%和1.36%，雄株葉片含膠量顯著高于雌株葉片；6月15日，雄株葉片含膠量增加更明顯，達(dá)1.83%，雌株增長(zhǎng)相對(duì)較少，為1.24%，二者差異顯著（圖1）。

2.1.2 杜仲莖皮含膠量變化 初春新生嫩莖長(zhǎng)出后，于4月中旬開(kāi)始，至6月15日，每隔15 d采摘1次，將皮剝下測(cè)定含膠量。結(jié)果表明：在4月15日至6月15日期間，雌、雄株莖皮中杜仲膠含量均不斷增加；4月15日，雌、雄株莖皮含膠量分別為0.76%和0.74%，二者差異不顯著；5月2日，雌、雄株莖皮含膠量分別為0.98%和0.84%，此時(shí)雌株莖皮含膠量顯著高于雄株；5月15日，雌、雄株莖皮含膠量分別為1.03%和1.40%，此時(shí)雄株顯著高于雌株，與葉片中含膠量相反；至6月15日時(shí)，雌、雄株含量分別為1.54%和2.01%，二者差異顯著（圖2）。

圖1 雌雄株葉片含膠量積累變化Fig. 1 Accumulation of rubber content in leaf of male and female

圖2 雌雄株莖皮含膠量積累變化Fig. 2 Accumulation of rubber content in stem of male and female

2.2 杜仲膠分子量變化

2.2.1 葉中杜仲膠分子量變化 雌株葉片中橡膠平均分子量呈上升趨勢(shì)，4月15日、5月2日、5月15日、6月2日、6月15日時(shí)平均分子量（Mw）分 別 為3.59×106、6.69×106、7.83×106、8.14×106、9.05×106Da。分子量分布隨著葉片增長(zhǎng)而變窄，4月15日至6月15日分子量分布(數(shù)均分子量/重均分子量)依次為4.14、2.73、2.64、2.48、2.01。杜仲雄株葉片中橡膠平均分子量從4月15日至6月15日同樣呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，平均分子量（Mw）依次為7.38×106、9.94×106、11.24×106、12.06×106、14.78×106Da。雄株葉片中膠平均分子量均大于雌株。雄葉分子量分布同樣隨著葉片增長(zhǎng)而變窄，4月15日至6月15日依次為5.30、4.06、3.31、3.3、2.65。說(shuō)明雌、雄株葉片中膠分子量分布均隨著葉片增大越來(lái)越集中。雌雄株葉片中橡膠不同分子量大小所占比列隨葉片增長(zhǎng)而發(fā)生變化，在4月15日至6月15日之間，雌雄株葉片中分子量在1.0×106Da以下所占比例分別從27.86%、17.08%降至1.10%、0.00%；分子量在1.3×107Da以上所占比例分別從3.60%、17.10%上升至20.20%、33.54%；此期間，雌、雄株葉片，分子量在1.0×106～5.0×106Da間所占比例最多（表1）。

2.2.2 莖皮中杜仲膠分子量變化 雌株莖皮中橡膠分子量從4月15日至6月15日呈上升趨勢(shì)，平均分子量（Mw）分別為2.51×106、3.68×106、4.18×106、4.53×106、4.71×106Da。分子量分布從4月15至6月5日在1.95至2.73之間，說(shuō)明雌株莖皮中橡膠分子量分布不隨莖皮增長(zhǎng)而變化。雄株莖皮中橡膠分子質(zhì)量從4月15日至6月15日同樣呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，平均分子量（Mw）分別為0.84×106、2.15×106、4.74×106、5.07×106、5.45×106Da。雄株莖皮中橡膠分子量分布從4月15至6月5日在3.00至3.50之間，說(shuō)明雄株莖皮中橡膠分子量分布同樣不隨莖皮增長(zhǎng)而變化。此期間，雌株橡膠分子量分布整體小于雄株莖皮。雌、雄株莖皮中橡膠不同分子量大小所占比列隨莖皮增長(zhǎng)而變化，在4月15日至6月15日之間，雌、雄株莖皮中分子量在1.0×106Da以下所占比例分別從44.61%、75.15%降至2.18%、15.74%；分子量在1.3×107Da以上所占比例分別從1.97%、0.93%上升至4.62%、12.76%；此期間，除4月15日時(shí)雄株莖皮中分子量小于1.0×106Da所占比例最多，其余均為分子量在1.0×106～5.0×106Da間所占比例最多（表1）。

2.2.3 果皮中杜仲膠分子量變化 果皮中橡膠分子量大小從4月15日至6月15日呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，平均分子量（Mw）分別為2.53×106、4.11×106、5.65×106、6.88×106、7.72×106Da。果皮中分子量分布隨果增長(zhǎng)而變窄，依次為4.88、4.49、2.61、2.33、2.25, 說(shuō)明隨著果增長(zhǎng)，果皮中膠分子量分布越來(lái)越集中。果皮中橡膠不同分子量大小所占比列隨果增長(zhǎng)同樣發(fā)生變化，在4月15日至6月15日之間，果皮中分子量在1.0×106Da以下所占比例從38.86%降至5.65%，分子量在1.3×107Da以上所占比例從4.76%上升至22.99%，分子量在1.0×106～5.0×106Da間所占比例最多（表2）。

表1 雌雄株葉片和莖皮橡膠分子量分布比例Table 1 Molecular weight distribution of rubber in leaf and stem of male and female %

表2 果皮橡膠分子量分布比例Table 2 Molecular weight distribution of rubber in fruit%

2.3 杜仲EuREF1基因表達(dá)特征與含膠量的關(guān)系

2.3.1 葉片中EuREF1基因表達(dá)特征與含膠量的關(guān)系 提取雌、雄株葉片mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以杜仲Actin為內(nèi)參基因，對(duì)4月15日至6月15日的杜仲雌雄株葉EuREF1基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：隨著葉片增長(zhǎng)，雌雄株葉片的EuREF1基因表達(dá)量不斷增加；6月2日時(shí)，雄株葉中EuREF1表達(dá)量是4月15日的6倍；到6月15日時(shí)，雌株葉片中EuREF1表達(dá)量繼續(xù)升高，而雄株葉片表達(dá)量與6月2日相比差異不顯著（圖3）。對(duì)雌、雄株葉片中含膠量與EuREF1表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析表明：雌株葉中的EuREF1基因表達(dá)量與其膠含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），R值為0.969 3；杜仲雄株葉中的EuREF1基因表達(dá)量與其膠含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），R值為0.910 5（表3）。

2.3.2 莖皮中EuREF1基因表達(dá)特征與含膠量的關(guān)系 以當(dāng)年發(fā)生的杜仲嫩枝分離樹(shù)皮組織的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Actin作為內(nèi)參基因，對(duì)4月15日至6月16日雌雄株莖皮中的EuREF1基因表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：雌雄株的莖皮組織中，EuREF1基因表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)。雌株莖皮6月15日EuREF1相對(duì)表達(dá)量是4月15日的2.2倍；雄株莖皮6月15日EuREF1相對(duì)表達(dá)量是4月15日的1.7倍（圖4）。對(duì)雌、雄株莖皮中含膠量與EuREF1表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析表明：杜仲雌株莖皮中EuREF1基因表達(dá)量與其膠含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），R值為0.952 2；雄株莖皮中EuREF1基因表達(dá)量與其膠含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），R值為0.988 0（表1）。

2.4 杜仲EuREF1基因表達(dá)特征與分子量的關(guān)系

2.4.1 葉片中EuREF1基因表達(dá)特征與分子量的關(guān)系 雌、雄株葉片中分子量與EuREF1基因表達(dá)量在4月15至6月15期間均呈上升趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)二者相關(guān)性分析表明：雌、雄株葉片中平均分子量與EuREF1基因表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），R值分別為0.942 8、0.898 2。

2.4.2 莖皮中EuREF1基因表達(dá)特征與分子量的關(guān)系 雌、雄株莖皮中分子量與EuREF1基因表達(dá)量在4月15至6月15期間均呈上升趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)二者相關(guān)性分析表明：雌、雄株莖皮中橡膠平均分子量與EuREF1基因表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），R值分別為0.937 4、0.905 1（表4）。

圖3 葉片EuREF1基因相對(duì)表達(dá)水平Fig. 3 Relative expression level of EuREF1gene in leaf

圖4 杜仲莖皮EuREF1基因相對(duì)表達(dá)水平Fig. 4 Relative expression level of EuREF1gene in stem

表3 EuREF1表達(dá)量與含膠量相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of EuREF1 expression and rubber content

表4 EuREF1表達(dá)量與橡膠分子量相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between EuREF1 expression level and molecular weight of rubber

3 討論

3.1 杜仲橡膠積累規(guī)律

杜仲所產(chǎn)的反式橡膠具有獨(dú)特的“橡膠-塑料”二重性[4]。杜仲的莖皮、葉片以及果皮中均含有杜仲膠，但隨著季節(jié)的不同，不同器官含膠量也不同。雌、雄株葉片或莖皮中含膠量均隨著器官生長(zhǎng)而增加；在杜仲生長(zhǎng)初期，葉片和莖皮中橡膠積累較緩慢，到5-6月時(shí)，橡膠積累量快速增加，與莫俊等[17]結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，含有杜仲橡膠的膠顆粒粒徑隨器官成熟而增大[18-19]，含膠細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核與細(xì)胞器隨著器官的發(fā)育而解體，并被橡膠顆粒充滿(mǎn)[20]。推測(cè)5月后環(huán)境條件適宜杜仲生長(zhǎng)發(fā)育，加速膠顆粒中橡膠合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，使得橡膠積累量增加。研究發(fā)現(xiàn)，雌、雄株莖皮中的含膠量均大于葉片，與杜紅巖結(jié)果一致[21]。杜仲葉中小膠顆粒、中等膠顆粒、大膠顆粒所占比例較平均，而皮中小膠顆粒所占比例為98.38%[19]，推測(cè)雌、雄株不同器官中含膠量雖都有增加，但增加量和總含量有差異可能與器官中所含膠顆粒大小有關(guān)。

3.2 杜仲膠分子量變化規(guī)律

杜仲膠是三倍半萜烯醇的一個(gè)高分子量同系物，主要由反式聚異戊二烯單體構(gòu)成，對(duì)杜仲雌、雄株不同時(shí)期葉片、莖皮與果皮中橡膠分子量進(jìn)行測(cè)定，在4月15至6月15期間，不同器官分子量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，但增加量有差異。Bamba等[22]在杜仲不同組織中檢測(cè)到低分子量聚異戊二烯的分布有組織特異性，認(rèn)為不同組織間聚異戊二烯伸長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同。對(duì)于雌雄株不同器官中不同時(shí)期各分子量大小所占比列而言，隨著器官生長(zhǎng)發(fā)育，小分子量橡膠占比逐步降低，而大分子量橡膠占比逐步增加，說(shuō)明各器官組織中橡膠分子量隨著器官生長(zhǎng)而增大。雌、雄株葉片、莖皮和果皮中，分子量在1×106～5×106KD間所占比例幾乎為最多，異戊二烯分子量為68.12 KD，說(shuō)明長(zhǎng)度在1.5萬(wàn)至7.4萬(wàn)個(gè)異戊二烯單體的橡膠最多。

3.3 EuREF1基因表達(dá)特征與分子量及膠含量的關(guān)系

對(duì)杜仲雌、雄株葉片和莖皮中EuREF1表達(dá)量與分子量大小和含膠量進(jìn)行比較，EuREF1在雌、雄株不同時(shí)期的葉片和莖皮中均有表達(dá)，且表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，與分子量大小變化規(guī)律和含膠量增長(zhǎng)規(guī)律呈正相關(guān)關(guān)系，葉片和莖皮中高分子量橡膠占比也逐步增加。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同時(shí)期杜仲雌、雄株各器官EuREF1基因表達(dá)量與含膠量、分子量比較分析，得出以下結(jié)論：EuREF1表達(dá)量與含膠量增長(zhǎng)規(guī)律呈正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)EuREF1基因產(chǎn)物與杜仲膠積累有密切關(guān)系；EuREF1表達(dá)量和分子量大小變化規(guī)律呈正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)EuREF1基因與橡膠鏈的延伸有關(guān)系，但仍需要直接證據(jù)。