赫玲玲， 程順利， 肖進彬， 王鵬曉， 方玉美

（河南省高新技術(shù)實業(yè)有限公司，鄭州 450002）

鉀是植物的必須營養(yǎng)元素，需求量較大，據(jù)土壤普查，中國有50%以上耕地土壤缺鉀，每年需進口含硫酸鉀、氯化鉀等化學肥料進行補缺. 其實，中國耕地土壤中含鉀量并不少，但95%的土壤鉀存在于鉀長石和云母這兩類礦物中，不能被植物有效利用［1］. 膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）又稱硅酸鹽細菌、膠質(zhì)芽孢桿菌，能分解鉀長石、云母等硅鋁酸鹽類的原生態(tài)礦物質(zhì)，使土壤中的不溶性K、P、Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄栽毓┲参锢茫尫趴扇苄遭}、硫、鎂、鐵、鉬、錳等中微量元素［2］，同時還可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)［3］. 膠凍樣芽孢桿菌的解鉀能力可以將植物難以利用的礦物鉀釋放為可以利用的有效鉀［4］，該類菌種能合理地利用本土鉀資源，改善土壤缺鉀的現(xiàn)狀［3-6］；其解鉀能力與其在土壤中的豐度及活性有密切關(guān)系. 有些菌株同時具有固氮、溶磷和解鉀三種作用［5］，不但可以增進土壤肥力，還可以有效提高化肥利用率［6］，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、礦物相關(guān)工業(yè)、環(huán)境治理等領(lǐng)域.

本研究以膠凍樣芽孢桿菌ACCC10013為試驗菌株，對其液態(tài)發(fā)酵過程中影響活菌數(shù)的培養(yǎng)基成分、發(fā)酵工藝條件進行試驗，以提高該菌株的單位活菌數(shù)為目標，期望獲得適宜的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）ACCC10013（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心）.

1.1.2 培養(yǎng)基

鉀細菌培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g、K2HPO40.5 g、酵母浸粉0.4 g、MgSO40.2 g、MgCl20.2 g、蒸餾水1 L、pH 7.0～7.2.發(fā)酵培養(yǎng)基：采用設(shè)計的培養(yǎng)基.

計數(shù)平板培養(yǎng)基：鉀細菌瓊脂培養(yǎng)基，即鉀細菌培養(yǎng)基，添加瓊脂粉18 g?L-1.

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

活化培養(yǎng)：將裝有膠凍樣芽孢桿菌的冷凍干燥安瓿管開啟后加入0.3 mL無菌水，使凍干菌種塊溶化呈懸浮狀，取菌懸液劃線于鉀細菌斜面培養(yǎng)基，待長出菌落后，挑取少許接種于鉀細菌培養(yǎng)基中30 ℃液態(tài)培養(yǎng)24 h得到菌種活化液.

保存方法：活化后的菌種液用兩種方法保存. 一是斜面保存法：用接種環(huán)取菌種活化液劃線于試管斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h得到斜面菌落，密封保存于6 ℃. 二是甘油管保存法：40%滅菌甘油與活化后的培養(yǎng)菌液按體積1∶1配制裝入安瓿管，在-80 ℃環(huán)境中保存.

生長曲線的測定：將甘油保存管膠凍樣芽孢桿菌按體積1‰接種于鉀細菌培養(yǎng)基中進行一次搖瓶培養(yǎng)，監(jiān)測其生長趨勢，繪出生長曲線；然后將上述一次搖瓶培養(yǎng)菌液按體積1%接種于鉀細菌培養(yǎng)基中進行二次搖瓶培養(yǎng)，監(jiān)測其生長趨勢，繪出生長曲線.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：搖瓶發(fā)酵時培養(yǎng)基的裝液量為20%. 上述二次搖瓶培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，將生長到對數(shù)培養(yǎng)期的種子培養(yǎng)液按體積的2%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行單因素試驗和正交試驗.

1.2.2 分析方法

菌量測定：采用平板計數(shù)檢測每毫升培養(yǎng)液中的活菌數(shù).

菌密度檢測：經(jīng)紫外-可見分光光度計測定吸光值.

pH值測定：經(jīng)pH計和精密試紙檢測.

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 碳源單因子篩選 固定氮源酵母浸粉為0.4 g?L-1，選取蔗糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜、玉米粉、麩皮等幾種常見的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為發(fā)酵碳源進行篩選.

1.3.2 氮源單因子篩選 固定碳源，選取胰蛋白胨、牛肉膏、豆粕、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3作為發(fā)酵氮源進行篩選.

1.3.3 碳源含量優(yōu)化 利用碳源單因素篩選中確定的最佳碳源，含量設(shè)計為5、10、15、20、25、30 g?L-1，進行優(yōu)化試驗.

1.3.4 氮源含量優(yōu)化 利用氮源單因素篩選中確定的最佳氮源，含量設(shè)計為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g?L-1，進行優(yōu)化試驗.

1.3.5 生長因子的選擇 因酵母浸粉營養(yǎng)豐富，可為膠凍樣芽孢桿菌的生長提供更好的環(huán)境，選其作為生長因子，含量設(shè)計為0、0.1、0.2、0.5、1.0 g?L-1進行優(yōu)化試驗.

1.3.6 無機鹽含量優(yōu)化 K2HPO4和MgSO4是發(fā)酵培養(yǎng)基中主要的無機鹽，為膠凍樣芽孢桿菌的生長提供主要的鉀、磷、鎂元素. 利用單因素實驗確定的最佳碳源、氮源及其含量，設(shè)計K2HPO4為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g?L-1，設(shè)計MgSO4為0.2、0.5、0.8、1.2 g?L-1，分別進行優(yōu)化試驗.

1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化 培養(yǎng)溫度、初始pH是影響菌生長的主要條件. 利用單因素實驗確定的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)計培養(yǎng)溫度為30、32、34、37 ℃，設(shè)計初始pH為6.5、7.0、7.5、8.0，分別進行優(yōu)化實驗.

1.3.8 正交試驗 通過單因素試驗確定膠凍樣芽孢桿菌的最佳碳源和中心水平，設(shè)計碳源含量、兩種無機鹽含量、發(fā)酵溫度進行4因子3水平正交試驗，尋找出較優(yōu)發(fā)酵配方及發(fā)酵條件（表1）.

表1 正交實驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.9 發(fā)酵罐試驗 通過單因素和正交試驗獲得了較優(yōu)發(fā)酵配方及發(fā)酵工藝條件，在此基礎(chǔ)上用50 L液態(tài)發(fā)酵罐進行發(fā)酵試驗，并監(jiān)測發(fā)酵過程中的活菌量及菌密度.

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定結(jié)果

取甘油保存管菌種按體積1‰接種于鉀細菌培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r?min-1搖瓶培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，并以空白培養(yǎng)基為對照測吸光度（圖1）. 0～12 h為適應(yīng)期，12～40 h為對數(shù)生長期. 根據(jù)生長趨勢選用24～32 h的培養(yǎng)液作為二次培養(yǎng)的種子菌液，按體積1%接種于鉀細菌培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r?min-1搖瓶培養(yǎng)，每隔3 h取樣一次，并以空白培養(yǎng)基為對照測吸光度（圖2）. 二次培養(yǎng)適應(yīng)期較短，生長較快，3 h后即進入對數(shù)生長期，根據(jù)生長趨勢選用24～27 h的培養(yǎng)液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的種子菌液.

圖1 膠凍樣芽孢桿菌一次生長曲線Fig.1 Primary growth curve of Bacillus mucilaginosus

圖2 膠凍樣芽孢桿菌二次生長曲線Fig.2 Secondary growth curve of Bacillus mucilaginosus

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 碳源 表2顯示不同氮源對膠凍樣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的影響. 在以蔗糖、甘油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)44 h后，活菌數(shù)相對較低，分別為0.4×107cfu?mL-1、1.2×107cfu?mL-1，且發(fā)酵后pH偏酸性；在以糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)較高，為12.2×107cfu?mL-1；在麥麩為碳源的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)為8.4×107cfu?mL-1. 經(jīng)分析可知，膠凍樣芽孢桿菌在蔗糖、甘油等速效碳源［5-7］的培養(yǎng)基中生長過快，衰老也過快，發(fā)酵后的活菌數(shù)相對低，培養(yǎng)基也隨之呈酸性；糖蜜中除了含有蔗糖，還含有泛酸和生物素等一些營養(yǎng)成分，在糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中，菌體生長較好，發(fā)酵后的活菌數(shù)相對高；可溶性淀粉、玉米粉、麥麩為遲效碳源［8-10］，菌種在生長過程中利用緩慢，菌種的生長繁殖也相對緩慢. 綜合菌量、成本等因素，確定糖蜜為最佳碳源.

表2 不同碳源對膠凍樣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的影響Tab.2 Effects of different carbon sources on liquid fermentation of Bacillus mucilaginosus

2.2.2 氮源 表3顯示不同氮源對膠凍樣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的影響. 酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏屬速效有機氮源，豆粕為遲效有機氮源，硫酸銨、氯化銨、硝酸銨為速效無機氮源［11-13］. 分別以酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕為氮源，固定添加量為2 g?L-1的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)44 h后，活菌數(shù)均可達到108cfu?mL-1以上，且發(fā)酵后pH偏堿性，其中以豆粕為氮源時活菌數(shù)最多，為5.3×108cfu?mL-1. 以硫酸銨、氯化銨、硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)相對較低，且發(fā)酵后pH偏酸性. 經(jīng)分析可知，有機氮源發(fā)酵后活菌數(shù)明顯高于無機氮源，且菌落生長狀態(tài)更好. 由于以無機氮源發(fā)酵后培養(yǎng)液偏酸性，培養(yǎng)時需要添加的較多堿液才能維持pH平衡. 綜合菌量、成本等因素，故確定豆粕為最佳氮源.

表3 不同氮源對膠凍樣芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on liquid fermentation of Bacillus mucilaginosus

2.2.3 碳源濃度 圖3顯示不同碳源濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖3可看出，當糖蜜在5～10 g?L-1范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨著碳源濃度的增加而增加；當糖蜜在10～20 g?L-1范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨著碳源濃度的增加而降低；當糖蜜在20～30 g?L-1范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨著碳源的增加而平緩. 當糖蜜為10 g?L-1時，活菌數(shù)最高為4.9×108cfu?mL-1；當糖蜜為20 g?L-1時，活菌數(shù)降到108cfu?mL-1以下，經(jīng)檢測，發(fā)酵菌液pH在6.0左右，為弱酸性環(huán)境. 故糖蜜選用10 g?L-1.

圖3 碳源濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

圖4 氮源濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

2.2.4 氮源含量 圖4顯示不同氮源含量對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖4可看出，當豆粕在0.5～1 g?L-1范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨著氮源濃度的增加而增加；當豆粕為1～2.5 g?L-1時，活菌數(shù)隨著氮源濃度的增加而相對平緩；當豆粕為2.5～3.0 g?L-1時，活菌數(shù)隨氮源濃度的增加而減少；當豆粕為2 g?L-1時，活菌數(shù)最高為5.7×108cfu?mL-1，比豆粕為0.5 g?L-1時高出35.7%. 經(jīng)檢測，氮源濃度對發(fā)酵后培養(yǎng)液的pH 影響不明顯，故豆粕選用2 g?L-1.

2.2.5 生長因子 酵母浸粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、多肽、核酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分，可為菌的生長提供更好的環(huán)境［9］，故選擇酵母浸粉作為其輔助的生長因子. 由表4可以看出，在上述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的酵母浸粉，活菌數(shù)隨其濃度的增加有不同程度的增加，綜合菌量、成本等因素，故酵母浸粉選用0.2 g?L-1.

2.2.6 無機鹽 圖5 顯示不同K2HPO4濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖5 可知，當K2HPO4為0.5～1.5 g?L-1時，活菌數(shù)隨著其濃度的增加而增加，且當K2HPO4為0.3～0.8 g?L-1時，活菌數(shù)增幅相對平緩；當K2HPO4為1.5 g?L-1時，活菌數(shù)最高為7.2×108cfu?mL-1，比K2HPO4為0.5 g?L-1時高出33%.

圖6顯示不同MgSO4濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖6可知，當MgSO4在0.2～1.2 g?L-1范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨著其濃度的增加而增加，當MgSO4為0.5～1.2 g?L-1時，活菌數(shù)增幅相對平緩. 當MgSO4為1.2 g?L-1時，活菌數(shù)最高為7.2×108cfu?mL-1，比MgSO4為0.2 g?L-1時高出33%.

表4 酵母浸粉濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Tab.4 Effect of yeast extract concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

圖5 K2HPO4濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.5 Effect of K2HPO4 concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

圖6 MgSO4濃度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.6 Effect of MgSO4 concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

2.2.7 溫度 圖7顯示不同的培養(yǎng)溫度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖7可知，當培養(yǎng)溫度在30～37 ℃范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨溫度的增加而增加. 膠凍樣芽孢桿菌在37 ℃培養(yǎng)時生長速度較快，同一發(fā)酵時間內(nèi)，活菌數(shù)較30 ℃時高出28.57%. 經(jīng)分析可知，菌體在較高溫度的發(fā)酵環(huán)境下易形成芽孢，有助于其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用. 在發(fā)酵前12 h發(fā)酵溫度保持在28～32 ℃，12 h后每2 h溫度提高1 ℃，在溫度升至36 ℃后維持該溫度，直至形成芽孢，產(chǎn)率可達到95%. 不同的菌株其最佳生長溫度不同［9］，但大都在30～37 ℃之間，若想得到最適宜的發(fā)酵溫度，仍需進行優(yōu)化實驗.

2.2.8 pH 圖8顯示不同的初始pH對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響. 由圖8可知，當初始pH在6.5 的弱酸性環(huán)境下時，活菌數(shù)相對較低，為2.9×108cfu?mL-1；當pH 在7.0～8.0范圍內(nèi)時，活菌數(shù)隨溫度的增加而增加，且相對平緩；當pH在8.0弱堿性環(huán)境下時，活菌數(shù)最高為4.7×108cfu?mL-1. 合適的初始pH值能夠縮短菌體的調(diào)整期［14］，加速菌體繁殖［15］. 故膠凍樣芽孢桿菌適宜在pH 為7.0～8.0的中性偏堿性條件下生長.

2.3 正交試驗

為了確定較優(yōu)培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取較窄的濃度范圍，進行4因素3水平正交試驗［14］. 從直觀分析表得知：這4 因素的主效應(yīng)排序為培養(yǎng)溫度>MgSO4>K2HPO4>糖蜜；F 比值分別為1.596、1.577、0.760和0.067. 溫度對膠凍樣芽孢桿菌的活菌數(shù)影響最大，其次是MgSO4濃度，而碳源糖蜜濃度對其影響不顯著，如表5、表6. 確定出較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：糖蜜12 g?L-1，K2HPO40.8 g?L-1，MgSO40.3 g?L-1，豆粕2.0 g?L-1，酵母浸粉0.2 g?L-1，MgCl20.2 g?L-1；發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH 7.0～8.0.

圖7 溫度對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.7 Effect of temperature concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

圖8 pH對膠凍樣芽孢桿菌菌量的影響Fig.8 Effect of pH concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

表5 正交試驗直觀分析Tab.5 Visual analysis of orthogonal experiment

表6 正交試驗方差分析Tab.6 Analysis of variance of orthogonal test

2.4 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵

通過單因素和正交試驗選出了較優(yōu)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝條件，在此基礎(chǔ)上，進行50 L 發(fā)酵罐試驗［15-18］. 發(fā)酵時接種量為5%，pH控制在7.0～8.0，溶氧控制在20%左右，發(fā)酵周期為52 h，每隔8～12 h取樣，采用平板計數(shù)法測菌量，并以空白培養(yǎng)基為對照測吸光度. 由圖9 可知，當發(fā)酵至36 h 時，活菌數(shù)最高，為1.85×109cfu?mL-1，隨后活菌數(shù)逐漸下降. 當發(fā)酵時間在0～36 h范圍內(nèi)時，吸光度與活菌數(shù)的增長趨勢保持一致；當發(fā)酵時間在36～44 h范圍內(nèi)時，活菌數(shù)有明顯下降，而吸光度下降較為平緩. 從發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果可知，在本實驗中優(yōu)化的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，該菌株未補料單批次的發(fā)酵培養(yǎng)時間在36 h附近，即可放料收集菌體，此時監(jiān)測的罐體內(nèi)溶氧不再明顯變化，罐內(nèi)的可用碳、氮源物質(zhì)相對缺乏，菌體生長緩慢，甚至芽孢不能正常萌發(fā)和生長繁殖. 但若需一定的芽孢數(shù)，還需微調(diào)發(fā)酵條件，并監(jiān)測芽孢形成率及芽孢數(shù)，以便達到生產(chǎn)要求（圖9中吸光度為樣品5倍稀釋后所得數(shù)據(jù)）.

圖9 發(fā)酵罐發(fā)酵過程中菌量及菌體密度監(jiān)測曲線Fig.9 Monitoring curve of bacteria quantity and density in fermentation process of fermenter

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由于膠凍樣芽孢桿菌菌株的來源、保存環(huán)境、研究方向等不同，其培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件與現(xiàn)有報道文獻存在一定的差異［12］. 王金玲［13］等進行條件優(yōu)化后發(fā)酵活菌數(shù)達到3.47×108cfu?mL-1；吳向華［14］等進行條件優(yōu)化后進行了發(fā)酵罐實驗，活菌數(shù)達到9.58×108cfu?mL-1.

通過單因素試驗和正交試驗確定較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及工藝條件為：糖蜜12 g?L-1，K2HPO40.8 g?L-1，MgSO40.3 g?L-1，豆粕2.0 g?L-1，酵母浸粉0.2 g?L-1，MgCl20.2 g?L-1；發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 7.0～8.0；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)44～46 h，活菌數(shù)可達到7×108cfu?mL-1，較優(yōu)化前顯著提高；在此基礎(chǔ)上用50 L發(fā)酵罐進行中試發(fā)酵，培養(yǎng)36 h左右即可收集菌體，活菌數(shù)可達到1.85×109cfu?mL-1，較王金玲［13］、吳向華［14］等有一定程度的提高.

如需要最佳發(fā)酵培養(yǎng)基各成分濃度及其發(fā)酵工藝條件，可進一步進行響應(yīng)面法設(shè)計試驗［18］. 優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在保證營養(yǎng)充足、提高活菌數(shù)的條件下，利用了較為廉價的原料，并且縮短培養(yǎng)周期，降低生產(chǎn)成本，為后期的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)參考.

3.2 討論

由于膠凍樣芽孢桿菌功能廣、應(yīng)用潛力大，一直是國內(nèi)外研究的熱點. 目前對其應(yīng)用主要集中在生物鉀肥、污水處理、生物冶金等方面［17］，相關(guān)研究的切入點可從以下方面入手.

1）活菌劑制備：膠凍樣芽孢桿菌作為微生物菌肥的主要功能菌［19］，可將其制成活菌制劑. 采用低溫多級干燥制粒新工藝，相比傳統(tǒng)離心噴霧干燥生產(chǎn)工藝，進口溫度和出口溫度低，更好地保留了生物活性，而且一次性獲得水分分散顆粒劑產(chǎn)品而不是粉劑產(chǎn)品［7］. 膠凍樣芽孢桿菌與秸稈生物質(zhì)炭進行復配，可延長其存活時間，提高其對土壤的解鉀效率［20］.

2）解鉀能力提高：有些研究者將膠凍樣芽孢桿菌經(jīng)過UV誘變處理，以期獲得一些較出發(fā)菌株的解鉀能力有所提高的突變株，但這些突變株在生產(chǎn)應(yīng)用中易發(fā)生回復突變，需不斷進行復壯誘變［21］.

3）功能開發(fā)：膠凍樣芽孢桿菌因其莢膜多糖還是一類良好的微生物絮凝劑，對重金屬Pb2+有吸附作用.菌株MY6-2絮凝劑對100～500 mg?L-1的Pb2+吸附活性［22］在80%以上；膠質(zhì)芽孢桿菌G14對重金屬鉻是一種有效的微生物吸附劑，在優(yōu)化后的條件下，最大吸附量［17］為257 mg?L-1. 膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）K02菌株制得的微生物吸附劑對重金屬離子Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr3+均有吸附作用［23］.