摘要：維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。目前，其檢驗方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，免疫檢驗法無法區(qū)分其亞型及同分異構(gòu)體，因此經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性或假陰性。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以檢驗速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點成為標(biāo)本內(nèi)小分子檢驗分析的金標(biāo)準(zhǔn)，快速應(yīng)用于臨床實驗室診斷的多個方向。為減少標(biāo)本采集量及一次進(jìn)樣同時檢驗多種維生素提供了檢驗平臺。

關(guān)鍵詞：檢驗原理;在維生素檢驗中的應(yīng)用;局限性

一、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢驗原理

經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本進(jìn)入超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)，經(jīng)色譜柱分離、純化和濃縮，被導(dǎo)入質(zhì)譜儀的離子源。標(biāo)本在離子源內(nèi)電離，帶電離子在接口內(nèi)進(jìn)行去溶劑，通過Q0聚集、冷卻進(jìn)入三重四級桿質(zhì)量分析器，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離。Q1質(zhì)量分析器被設(shè)定為選擇特定的母離子，母離子在Q2碰撞室碎化、裂解，產(chǎn)生的子離子進(jìn)入Q3質(zhì)量分析器進(jìn)行分離。檢驗器記錄離子的信號，然后將信號傳輸?shù)诫娔X繪制成圖譜。以穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)來校準(zhǔn)和消除測量誤差，將標(biāo)本與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算血清標(biāo)本中對應(yīng)維生素含量。具體如下：

二、在維生素檢驗中的應(yīng)用

維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。其中，脂溶性維生素包括維生素A、25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、維生素E、維生素K;水溶性維生素包括維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12以及維生素C。維生素是人體所必需的微量營養(yǎng)成分，是機(jī)體酶系統(tǒng)中輔酶的重要組成部分，對新陳代謝起調(diào)節(jié)作用。一般在體內(nèi)不能合成或合成量很少，需通過飲食等手段獲得。維生素缺乏或過量均會導(dǎo)致營養(yǎng)性疾病的發(fā)生，故提高維生素檢驗準(zhǔn)確性、特異性是滿足臨床檢驗診斷需求的必然。

不同維生素具有不同的分子式，化學(xué)性質(zhì)也不盡相同，即使相同維生素，也有不同的分子結(jié)構(gòu)。維生素檢驗從標(biāo)本預(yù)處理到準(zhǔn)確檢驗應(yīng)用方法都存在著不同的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光法無法區(qū)分維生素亞型及同分異構(gòu)體，易與自身內(nèi)抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性較低，因此經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性或假陰性。而且不同檢驗品牌試劑對不同目標(biāo)免疫化合物的免疫捕獲率也會存在一定差異，不同檢驗平臺的免疫檢驗方法結(jié)果可比性較差。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以檢驗速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點成為標(biāo)本內(nèi)小分子檢驗分析的金標(biāo)準(zhǔn)，快速應(yīng)用于臨床實驗室診斷的多個方向，逐漸被臨床檢驗醫(yī)學(xué)專家們所廣泛關(guān)注。在歐美國家，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為檢驗醫(yī)學(xué)行業(yè)協(xié)會公認(rèn)的生物標(biāo)本內(nèi)小分子分析的金標(biāo)準(zhǔn)方法，已被其權(quán)威檢驗機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用于臨床研究及診斷。

以維生素D檢驗為例，人體維生素D主要來源于經(jīng)陽光和皮膚作用合成的維生素D3，另一種來源是食物中的維生素D2，兩者均需要在肝臟中單羥基化為25-羥基維生素D3（25-OHD3）和25-羥基維生素D2（25-OHD2），然后再經(jīng)過腎臟兩次羥基化才能轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘奈⒘侩p羥基代謝產(chǎn)物1，25-（OH）2D，其中25-OHD2和25-OHD3是人體血清中25-羥基維生素D（25-OHD）主要的存在形式。同時人體中還存在25-OHD3的異構(gòu)體，但目前傳統(tǒng)的免疫檢驗方法無法區(qū)分亞型維生素D2、D3及異構(gòu)體。因此，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對于醫(yī)生干預(yù)補充維生素D2的人群，嬰幼兒及腎功能異常的患者具有重要意義，還可用于評價免疫法的交叉反應(yīng)程度。此外，由于維生素具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，免疫方法學(xué)需要不同的抗體及方法，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是分子水平的檢驗，可以一次進(jìn)樣同時檢驗多種維生素及其相關(guān)活性代謝產(chǎn)物。

一次標(biāo)本處理且檢驗多種維生素的難點在于各待測物在人體血清中的含量差別較大，如人體血清中維生素A、E的含量較高而維生素K的含量微乎其微，且各維生素的極性差別較大，傳統(tǒng)檢驗方法很難同時滿足對維生素在線性范圍內(nèi)進(jìn)行檢驗并滿足其高靈敏度的要求。此外，不同人體血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對維生素檢驗還存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。先進(jìn)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以實現(xiàn)同時檢驗多種維生素的需求，其優(yōu)勢在于：預(yù)處理方法采用96孔板方法，簡化了實驗步驟、大大縮短了預(yù)處理時間，提高了檢驗通量;采用梯度洗脫，在縮短分析時間的同時獲得了較好的去介質(zhì)及分離效果，一次進(jìn)樣可同時得到多種維生素檢驗結(jié)果。同時在預(yù)處理過程中添加內(nèi)標(biāo)以消除不同基質(zhì)標(biāo)本中內(nèi)源性物質(zhì)對待檢物的影響，進(jìn)而提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

三、局限性

專業(yè)人才培養(yǎng)是臨床實驗室迎接超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗時代來臨的基礎(chǔ)。不同于臨床常規(guī)檢測.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)專業(yè)人才需經(jīng)過長期培訓(xùn)、臨床實踐和經(jīng)驗積累，臨床實驗室應(yīng)在引入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)前充分重視專業(yè)人員的培養(yǎng)工作。目前，國內(nèi)臨床實驗室缺乏大量有經(jīng)驗的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)專業(yè)人才，這嚴(yán)重制約了質(zhì)譜技術(shù)快速轉(zhuǎn)化至臨床實踐。

我國臨床實驗室對質(zhì)譜檢驗新項目建立和方法性能評價的經(jīng)驗相對不足，大多參照國外文獻(xiàn)和少部分國內(nèi)經(jīng)驗進(jìn)行方法學(xué)建立、性能評價、設(shè)立評估標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理。這種自我管理模式為內(nèi)部質(zhì)量管理和外部標(biāo)準(zhǔn)化帶來巨大挑戰(zhàn)，因此亟待我國相關(guān)部門出臺針對質(zhì)譜相關(guān)的臨床實踐指南以規(guī)范質(zhì)譜臨床檢測。

國內(nèi)不同臨床實驗室間技術(shù)水平與能力參差不齊，人員素質(zhì)和檢驗系統(tǒng)存在一定差異，若放松對質(zhì)譜技術(shù)臨床應(yīng)用的監(jiān)督和管理，任其恣意發(fā)展，最終帶來的只能是“亂象”，而直接參照美國FDA的監(jiān)管，則將可能極大阻礙我國質(zhì)譜技術(shù)在臨床實驗室領(lǐng)域的發(fā)展。對于我國臨床實驗室現(xiàn)狀而言，質(zhì)譜技術(shù)臨床應(yīng)用的發(fā)展需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)重于監(jiān)管需求。如何滿足日益增長的臨床需求，鼓勵質(zhì)譜技術(shù)在臨床實驗室中得到科學(xué)普及和規(guī)范應(yīng)用則是我們需要考慮的問題。

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作者簡介：

尚麗麗，女，漢族，醫(yī)學(xué)學(xué)士（醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)），13年臨床實驗室工作經(jīng)驗，主要從事生殖遺傳，優(yōu)生優(yōu)育，亞健康評估等方向的檢驗研究工作。