陳 潔，張松賀，龔利雪，裘 箏

(河海大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098)

近年來，隨著水污染治理的增強，城鎮(zhèn)污水處理廠在處理城鎮(zhèn)污水方面發(fā)揮了重要的功能.當(dāng)前，《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)根據(jù)污染物濃度指標(biāo)(c(COD) 50～120 mg·L-1,c(NH3-N)≥5 mg·L-1,c(TN)≥15 mg·L-1,c(TP) 0.5～5 mg·L-1)將城鎮(zhèn)污水處理廠尾水分為一級標(biāo)準(zhǔn)、二級標(biāo)準(zhǔn)和三級標(biāo)準(zhǔn)，其中一級標(biāo)準(zhǔn)分為A標(biāo)準(zhǔn)和B標(biāo)準(zhǔn). 這些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度顯著高于地表水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，且顯著高于文獻報道的部分沉水植物的耐受濃度[2-4].然而目前研究多為某種營養(yǎng)物質(zhì)(氮或磷等無機物)對沉水植物生長及生理代謝活動的影響，關(guān)于城鎮(zhèn)污水廠尾水(一級A、一級B和二級)對沉水植物直接脅迫效應(yīng)的研究鮮有報道. 因此，闡明不同濃度污水廠尾水對沉水植物生理活動的影響，以了解沉水植物被用于處理污水廠尾水的人工濕地中的衰退機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)計

實驗所用沉水植物狐尾藻為從南京高淳水生植物繁育研發(fā)基地購買；實驗所用沉積物取自南京烏龍?zhí)侗韺映练e物，攪拌均勻后靜置備用. 實驗地點為河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室的溫室(溫室頂部帶有遮陽網(wǎng)，透光率約60%)，溫室依靠自然光，通風(fēng)條件良好，以模擬自然條件下不同濃度污水廠尾水排放對狐尾藻的生理影響. 將購回的植物均勻地種植于水箱中，并按1∶100的比例加MS培養(yǎng)液與自來水，觀察植物長勢，及時清理死亡的植株.

在溫室內(nèi)同一區(qū)域放置9個等體積的白色塑料水箱(670 mm×480 mm×390 mm，120 L)，每個水箱底部鋪設(shè)10 cm底泥，并加入90 L自來水. 待沉積物沉降均勻后，在各實驗桶中分別種植60株生長狀況良好且植株高度、重量等較均一的狐尾藻(生物量約200 g)，并穩(wěn)定一周. 實驗水質(zhì)設(shè)置3種濃度梯度：一級A、一級B和二級出水標(biāo)準(zhǔn)(參照《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002))，每組水質(zhì)設(shè)定3個平行. 實驗時間為2016年8月，實驗周期21 d，采集樣品后及時加水，保持水位恒定. 供試尾水水質(zhì)如表1所示，其中一級A、一級B和二級尾水分別定義為STPEA、STPEB和STPEC.

表1 供試模擬尾水水質(zhì)濃度 mg·L-1

實驗初始水質(zhì)根據(jù)城鎮(zhèn)污水處理廠尾水排放標(biāo)準(zhǔn)，在自來水中加入氯化銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀和蔗糖調(diào)至3種污水廠尾水水質(zhì)濃度(見表1). 試驗期間，每6 d采集各實驗桶中的水樣，于24 h內(nèi)完成氨氮、總氮、總磷和高錳酸鹽指數(shù)的檢測并添加NH4Cl、KNO3、KH2PO4和蔗糖用于維持水體氨氮、總氮、總磷和高錳酸鹽指數(shù)的設(shè)定值. 實驗開始后分別采集處理0，7，21 d的不同水質(zhì)的植物樣品. 預(yù)留10 g新鮮植物樣品用于葉綠素的測定，剩余樣品用液氮冷凍后放入超低溫冰箱 (-65 ℃) ，以便后續(xù)其他指標(biāo)的測定.

1.2 狐尾藻生理指標(biāo)測定方法

1.2.1 葉綠素的測定

葉綠素含量測定采用95%乙醇-丙酮提取法[5]，分別于645，663 nm波長下測定吸光度值，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總含量計算公式分別為

Chl=Chla+Chlb，

其中:A645和A663分別為645 nm 和663 nm下的吸光度值；V為提取液的體積，W為葉片的鮮重[6].

1.2.2 其余生理指標(biāo)的測定

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理和作圖使用 Excel 2013 及 Origin 8.5.利用 SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析和 Fisher’s 顯著性檢驗(LSD). 利用 Canoco 5.0 軟件繪制 RDA 圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 尾水脅迫對狐尾藻葉片的葉綠素含量影響

在試驗初期(0 d)，3種水質(zhì)條件下的狐尾藻葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量間無顯著差異(圖1)，狐尾藻葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量隨時間均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖1). 在尾水脅迫7 d時，STPEB處理下的葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量達到峰值，分別比初始值增加了1.32，1.53和1.38倍；在21 d時，STPEA處理下的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量達到最低值. 整體上，STPEB處理下的狐尾藻葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量始終高于STPEA和STPEC.

2.2 尾水脅迫對狐尾藻葉片內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量的影響

在3種處理中，狐尾藻葉片內(nèi)的可溶性蛋白和可溶性糖含量均在前7 d升高，后期逐漸下降(圖2)，而淀粉含量的變化趨勢有所不同. 其中，STPEC處理下的可溶性蛋白含量顯著高于STPEA和STPEB的(p<0.05); 而STPEB處理下的可溶性糖含量顯著高于STPEA和STPEC的(p<0.05)，實驗結(jié)束時3種處理中的可溶性蛋白和可溶性糖含量均顯著高于初始值(p<0.05). 葉片內(nèi)的淀粉含量在STPEA和STPEB處理下均隨時間逐漸增加，而在STPEC處理下隨時間逐漸下降，實驗結(jié)束時，STPEA處理下的淀粉含量分別是STPEB和STPEC處理下的1.40和1.89倍，三者差異顯著(p<0.05).

2.3 尾水脅迫對狐尾藻葉片內(nèi)丙二醛(MDA)和超氧陰離子含量的影響

2.4 尾水脅迫對狐尾藻葉片內(nèi)抗氧化物質(zhì)(SOD，CAT，GSH)的影響

3種處理中，狐尾藻葉片內(nèi)SOD活性和GSH含量隨脅迫時間的延長而增加，而CAT活性隨時間延長逐漸下降，如圖4所示. 脅迫7 d時，STPEA處理下的SOD活性分別是STPEB和STPEC的1.28和1.49倍；脅迫21 d時，STPEA和STPEC處理下的SOD活性無顯著差異(p>0.05)，但均顯著高于STPEB的(p<0.05). CAT活性在STPEA處理下始終高于STPEB和STPEC的，且脅迫7d時三者間差異顯著(p<0.05)，3種尾水處理下的CAT最終活性為STPEA>STPEB>STPEC. 狐尾藻葉片內(nèi)GSH活性在前7 d增長較快，7～21 d增長速度減慢；21 d時，GSH含量較第0 d明顯增加，且STPEA和STPEC處理下的GSH含量顯著高于STPEB的(p<0.05).

不同小寫字母(a，b，c)表示同一取樣時間不同處理組間存在顯著性差異，p<0.05；STPEA，STPEB，STPEC分別代表城鎮(zhèn)污水處理廠一級A、一級B和二級尾水.圖4 不同尾水條件下狐尾藻 SOD、CAT 和 GSH 的活性變化

2.5 水質(zhì)指標(biāo)與狐尾藻葉片內(nèi)生理指標(biāo)的潛在關(guān)系分析

圖5 不同尾水條件下狐尾藻葉片內(nèi)的生理指標(biāo)冗余分析

表2 尾水水質(zhì)與植物葉片生理指標(biāo)冗余分析(RDA)前兩軸的統(tǒng)計特征

表3 狐尾藻各項生理指標(biāo)的Spearman秩相關(guān)系數(shù)

3 討 論

葉綠素是植物進行光合作用必不可少的物質(zhì)，是植物對環(huán)境脅迫反應(yīng)敏感性的生理指標(biāo)[6,8]. 實驗中，3種尾水處理中的狐尾藻葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均在第7 d明顯升高，第21 d顯著下降(圖1). 這與顏昌宙等[9]對氨氮脅迫下輪葉黑藻葉片的葉綠素含量變化及劉燕等[10]對狐尾藻葉片在富營養(yǎng)水平下葉綠素含量的研究結(jié)果一致. 這表明尾水中的高營養(yǎng)鹽在短時間內(nèi)可以促進狐尾藻的光合作用，但持續(xù)脅迫會使狐尾藻的光合作用系統(tǒng)受到損傷.

植物在遭受各種逆境脅迫時，會迅速產(chǎn)生并積累可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以抵抗外界各種脅迫的傷害[5]. 可溶性糖在參與滲透調(diào)節(jié)的同時可為植物生長和對抗不利環(huán)境因素提供能量；可溶性蛋白不僅參與植物體內(nèi)大部分的代謝活動，還具有較強的親水性，可緩解因滲透脅迫所造成的細胞失水[11]. 筆者的研究中，狐尾藻葉片中可溶性糖、可溶性蛋白均在3種尾水處理7 d時激增，處理21 d時下降(圖2(a)～(b)). 說明狐尾藻通過提高可溶性糖和可溶性蛋白含量以適應(yīng)高營養(yǎng)鹽環(huán)境，但隨著脅迫時間的延長，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量減少，平衡機制受到破壞，抗逆性降低.

淀粉是植物主要的能量貯存物質(zhì)，其氧化后為植物生長提供能量，當(dāng)?shù)矸酆铣伤俾蚀笥诜纸馑俾?，會使淀粉積累，對光合作用造成反饋抑制，促進葉片老化[12]. 筆者的研究結(jié)果表明，淀粉含量在一級A和一級B尾水中隨時間的延長呈現(xiàn)出增加的趨勢(圖2(c))，這可能是尾水的持續(xù)脅迫導(dǎo)致狐尾藻呼吸代謝紊亂，產(chǎn)生的ATP減少，遏制了水解淀粉的能力，使植物體葉片中的淀粉含量升高，這與周勇輝等[13]的研究結(jié)果相似. 而二級尾水中淀粉含量隨時間呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是高營養(yǎng)鹽尾水使狐尾藻的光合作用減弱，葉片內(nèi)的淀粉逐漸被消耗或合成儲存量減少.