王建永

(鄭州師范學院 體育學院，河南 鄭州 450044)

運動性疲勞是源于肌肉疲勞和能量衰竭而引發(fā)的機體在特定水平上不能持續(xù)維持預(yù)定運動強度的一種自然生理現(xiàn)象，根據(jù)具體表現(xiàn)形式的不同又可分為軀體性疲勞和精神層面的疲勞[1-3].運動性疲勞對人體造成的負面影響較大，長期處于運動性疲勞的人群易引發(fā)過度訓練癥候群，如訓練動機不足、認知加工能力低下、情緒低落或出現(xiàn)異常消極癥狀[4].因此，如何延緩疲勞的發(fā)生和促進運動后身體的恢復(fù)是目前體育康復(fù)及醫(yī)療保健領(lǐng)域研究的熱點之一.牡蠣是一種珍貴的且營養(yǎng)價值極高的貝類動物，從中提取的多肽具有抗氧化、抗衰老、緩解疲勞等多種生物學作用[5-6].筆者主要從線粒體功能角度考察牡蠣多肽對線粒體氧化應(yīng)激、線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響，探討牡蠣多肽對運動性疲勞的保護機制，以期為進一步開發(fā)利用牡蠣多肽的保健功能提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2013-0009.牡蠣多肽，純度>99%(HPLC法測定)，陜西億康龍生物技術(shù)有限公司，4 ℃干燥保存.

1.2 試劑與儀器

試劑：谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、ELC發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒,南京建成生物工程研究所；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ試劑盒,上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；血乳酸(BLA)檢測試劑盒、尿素氮(BUN)檢測試劑盒、ATP含量檢測試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所；PGC-1α、TFAM抗體及羊抗兔二抗,Abcam公司；β-actin抗體,Santa Cruz公司；其他試劑均為分析純.

儀器：JA2003A型電子天平，上海精密儀器廠； G1115A型紫外分光光度計，安捷倫(中國)有限公司；FSH-2型高速電動勻漿機，北京瑞麗分析儀器公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特(中國)有限公司；DNM-9602型酶標儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司.

1.3 實驗方法

(1) 動物分組及給藥：取50只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為正常對照組，模型組，牡蠣多肽低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只.對正常對照組和模型組灌服生理鹽水，對牡蠣多肽組灌服低劑量(100 mg·kg-1·d-1)、中劑量(200 mg·kg-1·d-1)、高劑量(400 mg·kg-1·d-1)的牡蠣多肽溶液，連續(xù)灌服28 d.

(2) 訓練方案建立：參照黃燕峰等[7]的方法建立大鼠運動性疲勞模型，除正常對照組外，其他組大鼠進行為期4周的負重游泳訓練.具體方法為：每日對大鼠灌服藥物1 h后，將體重5%的鉛塊固定在其尾部，一切就緒后，放置大鼠于水深30 cm、水溫為(25±2) ℃的游泳池中進行游泳訓練.第一周設(shè)置每日訓練5 min，此后每遞增一周增加5 min.第4周末灌服藥物1 h后，對大鼠進行一次性力竭運動，力竭標準為大鼠運動、旋轉(zhuǎn)協(xié)調(diào)性明顯下降，身體下沉，鼻尖沒入水中超過10 s且不能再次浮出水面[8].

(3) 大鼠疲勞相關(guān)生化指標檢測：大鼠末次游泳力竭后，采用2%異戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動脈采血，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒操作說明測定血清BLA、BUN含量.同時小心摘取大鼠股四頭肌組織，并置于液氮中保存?zhèn)溆?

(4) 骨骼肌線粒體的提?。簩⒎蛛x后的肌肉組織剪碎，按重量體積比1∶9加入介質(zhì)I(3 mmol·L-1Hepes，0.25 mol·L-1蔗糖，0.5 mmol·L-1EDTA，pH 7.4)，充分勻漿后于800×g離心10 min，上清液于10 000×g離心10 min，沉淀加入介質(zhì)Ⅱ(2 mmol·L-1Hepes，0.5 mmol·L-1EDTA，0.3 mmol·L-1蔗糖，pH 7.4)，10 000×g離心10 min，再次的沉淀加入介質(zhì)Ⅱ配制成懸液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，線粒體蛋白含量采用BCA法進行檢測.

(5) 骨骼肌線粒體自由基相關(guān)指標測定:取500 μL線粒體懸液，冰上研磨5 min破膜，10 000×g離心10 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書測定骨骼肌線粒體錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量.

(6) 骨骼肌線粒體ATP合成能力及呼吸鏈復(fù)合體活性測定:線粒體ATP合成酶活性采用熒光素-熒光素酶發(fā)光法[9].向反應(yīng)介質(zhì)(0.5 μmol·L-1EDTA，3.0 μmol·L-1Hepes，0.25 mol·L-1蔗糖，0.1 mmol·L-1蘋果酸，1.0 mmol·L-1谷氨酸)中加入0.05 mg的線粒體和20 μmol·L-1的熒光素酶，多功能酶標儀讀取本底發(fā)光強度，然后再加入4 μmol·L-1ADP啟動反應(yīng)，再次讀取發(fā)光強度，記錄前后兩次發(fā)光強度變化.線粒體呼吸鏈復(fù)合體(RCC)Ⅰ～Ⅳ的活性檢測參考王增喜等[10]的方法，取10 μL線粒體蛋白加入RCC Ⅰ～Ⅳ反應(yīng)緩沖液2 mL中，以蒸餾水作空白對照，校正吸光度為0，3 min內(nèi)連續(xù)測定340，605，550，550 nm處吸光度值，以此表示骨骼肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶RCC Ⅰ～Ⅳ的活性.

(7) 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)活性測定：采用線粒體腫脹試驗檢測MPTP的開放程度[11].取0.3 mg· mL-1的線粒體溶液100 μL，加入2 mL反應(yīng)緩沖液，孵育2 min后，加入200 μmol·L-1CaCl2誘導線粒體腫脹，采用分光光度計分別檢測加入CaCl2即刻和反應(yīng)10 min后540 nm處的兩項吸光度值A(chǔ)0和A1，MPTP活性可用二者吸光度的差值(△A540=A0-A1)表示，數(shù)值越大，說明MPTP開放程度越大，線粒體腫脹程度越大.

(8) 骨骼肌PGC-1α、TFAM蛋白檢測:常規(guī)方法提取大鼠骨骼肌蛋白后，采用BCA法測定蛋白含量.取20 μL蛋白緩沖液進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入經(jīng)過5% BSA-TBST稀釋的PGC-1α、TFAM一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)，室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影，采用Imagine J軟件讀取蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，實驗所得灰度值除以內(nèi)參灰度值為蛋白相對灰度值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析處理，組間差異比較行單因素方差分析，p<0.05及p<0.01分別表示結(jié)果有顯著性差異和極顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 牡蠣多肽對各組大鼠BUN、BLA含量的影響

BUN及BLA是評價機體運動性疲勞的兩個重要生化指標.筆者的實驗結(jié)果列于表1.

表1 牡蠣多肽對各組大鼠BUN、BLA含量的影響 mmol·L-1

表1中的結(jié)果顯示:與正常對照組比較，模型組大鼠血清BUN、BLA含量顯著升高，表明機體在較強運動中其抵抗疲勞的能力顯著下降，但采用一定劑量的牡蠣多肽灌胃后，大鼠血清BUN、BLA含量有所降低，其中，低劑量組大鼠BUN、BLA含量較模型組顯著降低(p<0.05)，中、高劑量組大鼠BUN、BLA含量較模型組出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01).

2.2 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體自由基代謝相關(guān)指標的比較

分別采用血乳酸(BLA)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒對大鼠骨骼肌線粒體進行檢測，結(jié)果列于表2.

表2 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體自由基代謝相關(guān)指標的影響

由表2可知:與正常對照組比較，模型組大鼠骨骼肌線粒體中Mn-SOD及GSH-Px水平顯著降低，MDA含量顯著升高(p<0.01)；與模型組比較，牡蠣多肽低劑量組Mn-SOD及GSH-Px水平有所上升，MDA含量相對降低，而中、高劑量組骨骼肌線粒體中SOD及GSH-Px水平顯著升高，MDA含量顯著降低(p<0.01).

2.3 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及ATP合成能力的影響

各組大鼠骨骼肌線粒體RCC Ⅰ～Ⅳ的活性及ATP合成能力如表3所示.

表3 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及ATP合成能力的影響

由表3可知:與正常對照組比較，模型組RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成能力顯著降低(p<0.01);與模型組比較，牡蠣多肽低劑量組RCC Ⅰ～Ⅳ活性有所上升，ATP合成能力顯著上升，中、高劑量組RCC Ⅰ～Ⅳ活性和ATP合成能力均顯著升高，中、高劑量組與模型組比較，差異具統(tǒng)計學意義(p<0.01).

2.4 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體 MPTP開放狀況的影響

MPTP作為線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐，其開放狀態(tài)是否正常是維持線粒體穩(wěn)定性和細胞功能的重要因素[12].牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體 MPTP開放狀況的影響結(jié)果列于表4.

表4 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌線粒體MPTP開放狀況的影響

表4顯示:與正常對照組比較，模型組大鼠骨骼肌線粒體的MPTP開放情況顯著升高(p<0.01)，與模型組比較，牡蠣多肽低、中、高劑量組大鼠骨骼肌線粒體的MPTP開放有所下降，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01或p<0.05).

2.5 牡蠣多肽對大鼠骨骼肌PGC-1α、TFAM蛋白表達的影響

采用Western blot法檢測大鼠骨骼肌線粒體相關(guān)蛋白PGC-1α和TFAM的表達，其結(jié)果如圖1和表5所示.

(a)列為正常對照組；(b)列為模型組；(c)列為牡蠣多肽低劑量組；(d)列為牡蠣多肽中劑量組；(e)列為牡蠣多肽高劑量組.圖1 牡蠣多肽對力竭運動大鼠PGC-1α和TFAM蛋白表達的影響

表5 各組大鼠骨骼肌PGC-1α和TFAM蛋白表達情況比較

圖1和表5顯示:與正常對照組比較，模型組PGC-1α和TFAM顯著降低(p<0.01)；與模型組比較，牡蠣多肽中、高劑量組的PGC-1α和TFAM蛋白表達顯著升高(p<0.01或p<0.05)，且蛋白表達量與牡蠣多肽含量呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性.

3 討 論

運動性疲勞主要表現(xiàn)為運動耐力下降、能量缺失、軀體性疲勞以及機體恢復(fù)時間延長，在生化水平上通常采用血乳酸、尿素氮的含量來對其進行評價.乳酸作為糖酵解產(chǎn)物，是引起機體疲勞的主要因素，乳酸積聚越多，表明機體疲勞程度越嚴重.此外，血尿素氮作為機體承受體力負荷能力的重要指標，也常用于機體疲勞模型的評定中.筆者對運動后大鼠的血乳酸及尿素氮的檢測結(jié)果顯示模型組大鼠血乳酸、尿素氮含量較正常對照組大鼠顯著升高，說明高強度力竭運動可導致大鼠機體出現(xiàn)運動性疲勞，而運動過程中采用一定劑量牡蠣多肽進行灌胃后，各組大鼠血乳酸、尿素氮含量較模型組有所下降，表明牡蠣多肽可能具有一定的抗疲勞作用.

運動性疲勞多由肌肉過度運動引起，大量的氧自由基等有害物質(zhì)在大強度運動下不斷累積，骨骼肌出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，同時，運動性疲勞還可導致機體能量代謝出現(xiàn)紊亂，最終引發(fā)機體供能不足而產(chǎn)生身體疲勞感.大量研究表明，線粒體作為ATP合成的重要場所，在細胞能量中扮演著重要角色，線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙是引發(fā)機體疲勞的潛在因素，因此維持線粒體的結(jié)構(gòu)及功能正常對緩解機體運動性疲勞具有十分重要的意義[13-14].在高強度運動下，體內(nèi)氧化應(yīng)激不斷增強，氧自由基不斷攻擊組織細胞或線粒體等生物膜，使之出現(xiàn)損傷或細胞凋亡[15].MDA作為重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其值的高低反映了線粒體膜脂質(zhì)受氧自由基攻擊的嚴重程度.Mn-SOD和GSH-Px作為細胞線粒體中清除自由基的兩個重要活性酶，對線粒體的氧化應(yīng)激損傷起到十分重要的保護作用.在筆者的實驗中，模型組大鼠線粒體Mn-SOD和GSH-Px水平出現(xiàn)下降，MDA含量有所上升，表明運動型疲勞引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，補充牡蠣多肽后，大鼠線粒體Mn-SOD和GSH-Px水平上升，MDA含量有所下降，進一步說明牡蠣多肽可提高機體抗氧化能力，清除過多的氧自由基.

線粒體呼吸鏈體(RCC)是線粒體進行能量代謝的重要組成部件，其活性變化直接反映了ATP合成能力的強弱.常見的呼吸鏈復(fù)合體有RCC Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4種，共同作用于氧化磷酸化過程，并生成能量分子ATP.其中RCC Ⅱ是琥珀酸-泛醌氧化還原酶，其活性反映了細胞內(nèi)ATP的合成水平，RCC Ⅳ是細胞色素C氧化酶，作為呼吸鏈中末端氧化酶，主要負責電子傳遞，促使ADP磷酸化形成ATP.大量研究表明，大劑量高強度訓練或急性離心運動可導致RCC活性下降，骨骼肌工作效率及運動能力降低[16-17].筆者的研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，力竭運動后的模型組大鼠RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成能力顯著下降，每日補充一定劑量的牡蠣多肽可一定程度上提高RCC Ⅰ～Ⅳ活性及ATP合成，以此提供更多的能量，緩解過度運動造成的生理性疲勞.

MPTP是由位于線粒體內(nèi)膜和外膜上的多種蛋白組成的蛋白復(fù)合體，對于維持細胞能量代謝和線粒體的正常功能起著重要作用.正常生理情況下，MPTP處于一種短暫的、間歇性的低通透性開放狀態(tài)，線粒體內(nèi)膜只對某些代謝底物和離子進行選擇性通透，以保持ADP/ATP的轉(zhuǎn)運，維持線粒體的正常功能.當MPTP受外界過強刺激會呈現(xiàn)出一種不可逆的高通透性開放狀態(tài)，膜外大量小分子物質(zhì)會非選擇性地進入線粒體內(nèi)，造成線粒體滲透壓增大，線粒體腫脹，引起外膜破裂.尚畫雨等[18]報道疲勞引起的氧化應(yīng)激可導致MPTP過度開放，通過對骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)肌纖維內(nèi)線粒體成空泡化，線粒體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出嚴重的異常.筆者的研究結(jié)果顯示，過度運動后的模型組大鼠MPTP活性顯著增加，牡蠣多肽各劑量組MPTP活性相對降低，進一步證實了牡蠣多肽可通過降低MPTP活性，調(diào)控線粒體開放狀態(tài)，從而發(fā)揮機體抗疲勞的作用.

已有大量研究表明，PGC-1α在調(diào)控細胞線粒體生物合成和功能維持中發(fā)揮著重要作用[19-20].PGC-1α作為一個重要的調(diào)控蛋白通過與核呼吸因子NRF-1，NRF-2結(jié)合，共同刺激下游通路線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)的表達，以此維持線粒體的正常復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，為細胞代謝提供能量.此外，研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α在維持線粒體呼吸功能的同時還可增加SOD和GSH-Px酶的表達，以此幫助細胞在氧化能力改變的同時仍然保持正常的氧化還原狀態(tài).筆者的實驗通過Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠在高強度運動后，線粒體PGC-1α和TFAM的表達顯著下降，相比較于模型組，牡蠣多肽組大鼠骨骼肌PGC-1α和TFAM的水平顯著升高，提示牡蠣多肽可能通過上調(diào)PGC-1α和TFAM的水平，提高細胞能量供給，維持肌肉組織線粒體功能的正常.

綜上所述，牡蠣多肽可對抗運動型疲勞，其機制可能與改善線粒體氧化應(yīng)激狀態(tài)、降低線粒體膜的通透性、強化呼吸功能、上調(diào)PGC-1α和TFAM的表達相關(guān).