燕高偉, 劉玉晴, 張 彤, 王田幸子, 李莉云, 劉國振, 竇世娟

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071001）

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物之一，也是研究單子葉植物的模式生物。隨著全球環(huán)境持續(xù)變暖，極端氣候?qū)掖纬霈F(xiàn)，自然災(zāi)害頻繁發(fā)生，給水稻帶來很多不可預(yù)知的風(fēng)險，冷、熱、旱、淹、鹽等環(huán)境條件是影響水稻產(chǎn)量的重要環(huán)境因素。而水稻白葉枯病、稻瘟病、紋枯病則是影響水稻產(chǎn)量的三大病害。為了克服這些非生物和生物脅迫，植物會通過一系列信號分子感知外界信息，引發(fā)體內(nèi)抗性反應(yīng)。

病程相關(guān)蛋白質(zhì)（Pathogenesis-related proteins, PR）是防衛(wèi)體系的重要組成部分，水稻中有900 多個PR 基因［1］，在水稻的生長發(fā)育過程和抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，受多種植物激素、病原菌和非生物脅迫誘導(dǎo)［2-3］。水稻PR1 家族屬于類絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidase-like proteins, SCPLs）， 水稻中包含99 個該家族成員。其中OsPR1A 是最早被鑒定和克隆出來的病程相關(guān)蛋白質(zhì)之一，被廣泛作為抗性反應(yīng)的標(biāo)志物。OsPR1A 的表達(dá)受多種生物脅迫的誘導(dǎo)，也對激素和其他刺激產(chǎn)生響應(yīng)［2-4］。 在水稻與白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 簡稱Xoo）互作反應(yīng)中，OsPR1A、OsPR1B 和OsPR10A 蛋白質(zhì)在Xoo 侵染水稻葉片144 h 后大量表達(dá)［3］。 細(xì)胞質(zhì)中與活性氧（Reactive oxygen species, ROS） 清除系統(tǒng)有關(guān)的一種non-RD 類受體激酶rrsRLK（Required for ROS-scavenging receptor-like kinase， LOC_Os01g02290），其缺失突變體（ΔrrsRLK）中過氧化物酶體的異常生物生成、過氧化氫（H2O2）的積累以及活性氧清除酶活性的降低，OsPR1a、OsPR1b、OsLOX 和茉莉酸（Jasmonic acid, JA）相關(guān)基因的表達(dá)顯著升高，對許多Xoo 菌株具有較強(qiáng)的抗性［5］。水稻幼苗外施JA 等處理，OsPR1a 基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)［2］。眾所周知，JA 在抵抗病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用。而光照與JA 有著非常密切的關(guān)系，有研究表明，庇蔭條件下導(dǎo)致擬南芥光敏色素B 部分失活，誘發(fā)磺基轉(zhuǎn)移酶ST2a 上調(diào)表達(dá)，催化JA 的活性形式（JA-OH）硫化形成非活性JA（JA- HSO4），下調(diào)JA 相關(guān)的防御反應(yīng)并促進(jìn)生長相關(guān)的激素途徑，使植物充分發(fā)揮庇蔭反應(yīng)，提高競爭力。這種光介導(dǎo)的生長/防御平衡變化對植物適應(yīng)和作物產(chǎn)量有重要影響［6］。

處于植物防御反應(yīng)信號下游的蛋白質(zhì)OsPR1A在不同光照條件下的響應(yīng)機(jī)制以及在協(xié)調(diào)生長/防御反應(yīng)中的作用，尚未見報道。本試驗旨在通過不同光照處理，研究OsPR1A 的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究光照-激素-生長/防御關(guān)系奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻的種植

將水稻4021 種子在27 ℃下放入水中浸種2 d，裝入2/3 體積的自然土，然后再上方裝入1/3 過篩的自然土，將花盆放入水槽中過夜以浸濕土壤，再將浸泡的種子用鑷子種于土中，27 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)至少3 周，期間注意及時補(bǔ)充水槽內(nèi)的水確保水位高于最高的花盆孔。

1.2 水稻全蛋白質(zhì)的提取

葉片或根部材料保持冷凍狀態(tài)，鋼珠震蕩研磨成粉末，按1∶10 質(zhì)量體積比加入提取緩沖液，低溫渦旋30 s，之后低溫靜置2 min，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清，按照上清液： 上樣緩沖液 buffer 為1∶4 的比例混勻。沸水浴15 min，-4 ℃凍存。

1.3 蛋白質(zhì)樣品的WB 檢測

配制Tricine 凝膠，用架子夾好后放入電泳槽內(nèi)，在架子中央倒?jié)M電泳液并在電泳槽內(nèi)倒入電泳液沒過底部導(dǎo)線，分別在膠孔中按照一定順序點蛋白質(zhì)樣品（10 μL）；SDS-PAGE 膠電泳條件160 V， 70 min，無需冰上電泳；Tricine 膠電泳條件80 V，20 min，然后增至160 V，1 h 20 min，需要冰上電泳。期間用無SDS 轉(zhuǎn)移液浸泡海綿墊片及濾紙，處理PVDF 膜（PVDF 膜剪成5.5 cm×8.5 cm，在其中一面左上角做好標(biāo)記，20 mL 甲醇在搖床上搖動浸泡5 min，加入60 mL 水搖動浸泡2 min，無SDS 轉(zhuǎn)移液浸泡15 min，電泳結(jié)束后在膠的左上角做好標(biāo)記，浸泡于無SDS 轉(zhuǎn)移液中，10 min）。墊片-3 層濾紙-膠-膜-3 層濾紙-墊片的順序壓好并放入轉(zhuǎn)膜槽，膜對著正極，膠對著負(fù)極；加入SDS 轉(zhuǎn)移液和冰盒，放于冰中；70 min，90 V。之后將PVDF 膜放入30 mL 10%脫脂牛奶中，1.5 h；20 mL10%脫脂牛奶中加入5 mL 一抗（一抗為Anti-OsPR1A，Anti-OsHSP），慢搖5 min，放入PVDF 膜，常溫慢搖3 h 或4 ℃ 過夜。TTBS 沖洗5 min，重復(fù)3 次。20 mL 10%脫脂牛奶中根據(jù)一抗加入2 mL 兔二抗或1 mL 鼠二抗（二抗與5%牛奶比例為1∶10 000），放入PVDF 膜，慢搖1.5 h。TTBS 沖洗5 min，重復(fù)3 次。1 mL 顯色液充分滴淋于PVDF 膜上，曝光顯影。通過Lane 1D 采集信號。

1.4 水稻非生物脅迫的處理

水稻非生物脅迫（冷、熱、旱、淹、鹽、光照）等處理材料和方法參考文獻(xiàn)［7］，其建立了水稻幼苗脅迫處理的蛋白質(zhì)樣品資源庫。將4021 水稻浸種2 d 后種于盆中，保持泥土濕潤，27 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)3 周后，按照4 ℃、44 ℃、48 ℃，旱、淹、鹽，全黑暗和全光照對水稻幼苗進(jìn)行處理，按照不同時間點對地上部分進(jìn)行取材，電泳，然后WB 檢測。

1.5 水稻活體的光照處理

將4021 水稻種子浸種發(fā)芽后，以土培培養(yǎng)方式培育水稻幼苗，待處理的水稻幼苗分別置于全黑暗、全光照、12 h 光照/12 h 黑暗的光照環(huán)境中，3 組溫度均控制在27 ℃，以0、1、2、3、4、5、6、7、和8 d 時間點分別對3 種不同光照條件下的水稻取材并拍照。

1.6 水稻葉片的遮光處理

將土培30 d 的活體葉片用錫紙包住5 cm，27 ℃ 條件下24 h 光照培養(yǎng)5 d，將錫紙取下拍照后，分別取葉片被遮光部分和未遮光部分，提取總蛋白，進(jìn)行WB 分析。

1.7 水稻離體葉片的遮光處理

將4021 水稻種子浸種發(fā)芽，以土培培養(yǎng)方式培育水稻幼苗，將水稻葉片剪約2 ～3 cm 長，培養(yǎng)皿內(nèi)倒入無菌水，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放水稻葉片數(shù)片，將培養(yǎng)皿分為3 組，分別置于全黑暗、全光照、12 h 光照/12 h 黑暗的光照環(huán)境中，3 組溫度均控制在 27 ℃，以0、1、2、3、4、5、6 和7 d 時間點分別對 3 種不同光照條件下的水稻離體葉片取材并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPR1A 蛋白質(zhì)對非生物脅迫的響應(yīng)

病程相關(guān)蛋白質(zhì)各家族成員，在植物抗性反應(yīng)中的分工各有不同，OsPR1A 在受病原菌誘導(dǎo)和激素調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，而對非生物脅迫響應(yīng)情況尚不明確。非生物脅迫處理結(jié)果如圖1 所示，在冷和48 ℃熱處理條件下，OsPR1A 表達(dá)整體上比對照有所上調(diào)，但隨時間變化規(guī)律并不明顯；PEG6000 模擬干旱、淹和鹽處理條件下，OsPR1A蛋白質(zhì)表達(dá)不明顯；而對于光照的響應(yīng)最為強(qiáng)烈，全黑暗條件下OsPR1A 表達(dá)量基本呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，全光照下OsPR1A 表達(dá)量逐漸升高。因此，OsPR1A 在活體水稻幼苗中的表達(dá)是受光的誘導(dǎo)。

圖1 水稻OsPR1A 在非生物脅迫下的表達(dá)Fig. 1 Expression of rice OsPR1A protein during abiotic stress treatments

2.2 OsPR1A 蛋白質(zhì)在不同光照條件下的表達(dá)情況

2.2.1 活體水稻幼苗OsPR1A 蛋白質(zhì)在不同光照條件下的表達(dá)情況 為了進(jìn)一步說明OsPR1A 蛋白質(zhì)對光的響應(yīng)，單獨對水稻進(jìn)行光照處理和水稻葉片取材。全黑暗條件下，葉片隨著時間的延長逐漸下垂，而全光照條件下，水稻幼苗葉片生長情況良好。取葉片進(jìn)行WB 檢測OsPR1A 蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，全黑暗下OsPR1A 表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢，而全光照下OsPR1A 表達(dá)量逐漸上調(diào)（圖2），與圖1 的水稻地上部取材結(jié)果一致。為了進(jìn)一步驗證該試驗結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，以及保證光照不因為取材時間而被打破，接著進(jìn)行了活體葉片遮光處理。

圖2 水稻幼苗OsPR1A 蛋白質(zhì)在不同光照條件下的表達(dá)Fig. 2 Expression of OsPR1A protein in rice seedlings under different light conditions

2.2.2 活體水稻幼苗OsPR1A 蛋白質(zhì)在遮光條件下的表達(dá)情況 為了使光照條件更加具有連續(xù)性和一致性，用錫箔紙包裹進(jìn)行遮光處理（圖3A），光照培養(yǎng)5 d 后，將錫箔紙取下，被遮光部分出現(xiàn)葉片變黃的現(xiàn)象（圖3B）。經(jīng)WB 檢測發(fā)現(xiàn)，錫箔紙全黑暗處理部分OsPR1A 表達(dá)量下降，溫室培養(yǎng)的未遮光部分的葉片中OsPR1A 表達(dá)量高（圖3C）。由此證實，遮光處理可以抑制OsPR1A 的表達(dá)。

圖3 遮光處理對水稻幼苗OsPR1A 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig. 3 Effects on the expression of OsPR1A protein in rice seedlings with shading treatment

2.2.3 水稻離體葉片中OsPR1A 在不同光照環(huán)境下的表達(dá)情況 對離體葉片進(jìn)行光照處理，比活體材料易于操作、受光均勻且數(shù)據(jù)穩(wěn)定。由結(jié)果可見，隨著時間的延長，3 組葉片都出現(xiàn)了變黃的現(xiàn)象，且變黃程度為：全黑暗＞12 h 光照/12 h 黑暗＞全光照（圖4A）。進(jìn)行WB 檢測后發(fā)現(xiàn)，全黑暗環(huán)境下OsPR1A 表達(dá)量很低，12 h 光照/12 h 黑暗下OsPR1A 表達(dá)量有所提升，全光照下OsPR1A 表達(dá)量最高（圖4B），進(jìn)一步證實光照可誘導(dǎo)OsPR1A的表達(dá)。

圖4 水稻離體葉片中OsPR1A 蛋白質(zhì)在不同光照條件下的表達(dá)Fig. 4 Expression of OsPR1A protein in rice leaves in vitro under different light conditions

3 討論與結(jié)論

病程相關(guān)基因根據(jù)其序列的相似性、編碼的蛋白質(zhì)活性和結(jié)構(gòu)等分為17 個家族。PR1 基因經(jīng)常被作為抗病反應(yīng)的標(biāo)記基因［8］，PR1 家族具有類絲氨酸羧肽酶活性。PR2 具有β-1,3 葡聚糖酶活性，PR3、PR4、PR8 和PR11 具有幾丁質(zhì)酶活性，這些家族成員可能通過破壞病菌細(xì)胞壁，對植物起到保護(hù)作用［1,9］。PR6 是蛋白酶抑制劑類，可以有效抑制昆蟲進(jìn)食或病菌蛋白酶的活性［10］。PR9 具有過氧化物酶活性，通過調(diào)節(jié)酶的活性來平衡正常生長發(fā)育中過氧化氫的積累和抗性反應(yīng)中過氧化氫對病菌的抑制作用［11］。PR12 是植物防御素類，形成一套天然的防御系統(tǒng)以對抗病原菌的侵染［12］。

水稻中共有900 多個PR 基因，種類繁多，功能多樣，即使同一家族成員有相互協(xié)作又各自分工。PR 基因除了在抵抗各種生物脅迫，如水稻白葉枯病菌、稻瘟病菌和紋枯病菌等外［13］，在非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用。植物對非生物脅迫的生理生化反應(yīng)具有組織器官特異性，冷主要發(fā)生在葉片 中［14］，鹽發(fā)生在根［15］和葉鞘基部［16］，旱發(fā)生在葉 片［17］和葉鞘［18］，但不同器官的應(yīng)激反應(yīng)也是共同的，只是存在時間進(jìn)程上和靈敏度上的差異。水稻幼苗受冷脅迫時，與糖代謝、脂代謝等能量相關(guān)蛋白質(zhì)被激活，應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)迅速上調(diào)，而防御相關(guān)蛋白質(zhì)在長期低溫脅迫下消失［19］。在水分充足的水稻根系中，熱激蛋白完全缺失，而干旱脅迫下，病程相關(guān)蛋白普遍上調(diào)，包括6 個幾丁質(zhì)酶、PR10 家族Bet v I 和RSOsPR10 以及PR5 的類甜蛋白質(zhì)家族成員等［20］。本試驗研究表明，在冷和48 ℃熱處理條件下，OsPR1A 表達(dá)隨處理時間進(jìn)程比對照有所上調(diào)，而干旱、淹和鹽處理條件下，OsPR1A 蛋白質(zhì)表達(dá)不明顯。

光照是影響植物生長發(fā)育的最重要的環(huán)境因子之一，適宜的光照也是植物建立一套完整的防御反應(yīng)的必要條件。不合理的光照，如黑暗或庇蔭也屬于非生物脅迫范疇，密植條件下植物優(yōu)先選擇避蔭 而不是防御［6］。JA 和H2O2能誘導(dǎo)OsPR1a 和 OsPR1b 的表達(dá)，而黑暗處理即大大降低其表達(dá)［2］。 水稻光敏色素三突變體中（phyAphyBphyC），OsPR1a 和OsPR1b 的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型，新葉和老葉都對稻瘟病菌敏感，表明水稻對稻瘟病菌的抗性可能是通過調(diào)節(jié)JA 或水楊酸（Salicylic acid, SA）依賴的防御途徑而實現(xiàn)的［21］。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）系統(tǒng)由MAPKKK-MAPKK-MAPK 組成，在水稻中約有75 種MAPKKK［22］、9 種MAPKK［23］和17 種MAPK［24］。敲低OsMPK6 可以提高水稻對白葉枯病菌的抗性，同時伴隨著SA 的積累和OsPR1a 轉(zhuǎn)錄水平的增高，說明OsMPK6 參與了SA 的防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［25］。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate, MeJA）處理水稻離體葉片后OsMPK17 蛋白質(zhì)表達(dá)豐度下降，而超表達(dá)OsMPK17 卻增強(qiáng)了水稻的耐旱性［26］，暗示OsMPK17 可能負(fù)調(diào)控JA 介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，而正調(diào)控脫落酸（Abscisic acid, ABA）介導(dǎo)的抗旱等非生物脅迫反應(yīng)。WRKY 家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與水稻的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫、發(fā)育和代謝過程等，粳稻品種日本晴中鑒定到89 個WRKY 成員［27］。采用微量熱泳動技術(shù)，發(fā)現(xiàn)WRKY42 與病程相關(guān)基因OsPR1a和OsPR1b 啟動子區(qū)順式元件W-box 的互作［28］。

本試驗結(jié)果表明，OsPR1A 無論是在活體中還是在離體中都受光的誘導(dǎo)，光可通過光敏色素將信號傳遞給激素，進(jìn)一步調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)反應(yīng)。本課題組通過WB 分析，初步研究證實JA 處理也可使OsPR1A 蛋白質(zhì)表達(dá)量升高。由此可見，OsPR1A可能是多條信號途徑的共同元件，來最終平衡生長發(fā)育和抗性反應(yīng)的關(guān)系，以利于植物適應(yīng)各種環(huán)境變化。本研究旨在建立OsPR1A 蛋白質(zhì)的光照/ JA/ Xoo 的誘導(dǎo)表達(dá)平臺，并“基于抗體的水稻蛋白質(zhì)組學(xué)”策略，利用實驗室前期積累的和文獻(xiàn)查閱的大量MAPK、WRKY 和PR 等的抗體，通過WB、轉(zhuǎn)基因和突變體等技術(shù)，找出不同信號通路的關(guān)鍵元件及處于中心樞紐的公共元件，深入研究光照及其它脅迫－激素－生長/ 防御的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并為水稻抗病分子育種奠定堅實的基礎(chǔ)。